運(yùn)動(dòng)促衰老骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化的線粒體重構(gòu)機(jī)制研究.pdf

1、目的：骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化能力降低是衰老性肌萎縮發(fā)生機(jī)制之一,氧化應(yīng)激是造成衰老衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化障礙的重要原因。適量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可降低衰老衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平,與成肌分化能力增加相關(guān),但具體機(jī)制尚不清楚。研究表明,衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程也是線粒體重構(gòu)的過程,且線粒體重構(gòu)可逆向調(diào)控衛(wèi)星細(xì)胞分化能力及定向性。我們前期工作證明,ROS過高產(chǎn)生氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體異常重構(gòu),啟動(dòng)病理信號(hào);而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可通過適量上調(diào)ROS,發(fā)揮其信號(hào)分子效應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)線

2、粒體適應(yīng)性重構(gòu),實(shí)現(xiàn)健康效應(yīng)。本研究從ROS生理/病理雙重作用角度探討運(yùn)動(dòng)促衰老衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化的機(jī)制:1)建立衰老性肌萎縮小鼠模型及耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)模型,利用原代培養(yǎng)技術(shù)獲得骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,并體外誘導(dǎo)分化,探討ROS生成、線粒體重構(gòu)(能量代謝、生物合成、融合分裂、嵴重構(gòu))及相關(guān)信號(hào)通路的變化規(guī)律及潛在關(guān)聯(lián);2)并以C2C12成肌細(xì)胞為研究對象,觀察成肌分化各時(shí)程ROS生成、線粒體重構(gòu)及相關(guān)信號(hào)通路的變化規(guī)律,以探討生理?xiàng)l件下它們之間的

3、時(shí)序關(guān)系;3)對照觀察不同水平外源性H2O2對成肌分化中線粒體重構(gòu)的影響,進(jìn)一步驗(yàn)證“運(yùn)動(dòng)通過改變ROS水平和線粒體重構(gòu)調(diào)控衰老衛(wèi)星細(xì)胞分化”的假設(shè);并利用mTOR特異性激動(dòng)劑和阻斷劑干預(yù)上述模型,探討mTOR是否參與ROS雙向調(diào)控成肌分化的切換機(jī)制。
　　方法：1)雄性C57BL/6小鼠48只,包括青年鼠(2月齡,24只)和老年鼠(12月齡,24只)。分為青年對照組、青年運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組、老年對照組和老年運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組。訓(xùn)練組小鼠進(jìn)行12

4、周跑臺(tái)耐力訓(xùn)練。處死后計(jì)算腓腸肌濕重/體重比值,并HE染色測量肌纖維橫截面積;剩余肌肉用兩步酶消化法分離骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,免疫化學(xué)染色鑒定衛(wèi)星細(xì)胞純度;原代培養(yǎng)并體外誘導(dǎo)成肌分化24h。倒置顯微鏡觀察衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化程度;Oxygraph-2k細(xì)胞呼吸測量儀測定透膜細(xì)胞中線粒體氧耗速率;熒光素-熒光素酶發(fā)光法測定ATP合成酶活性;JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位;DCFH-DA熒光探針檢測細(xì)胞ROS水平和線粒體ROS生成速率;電鏡檢測線粒

5、體超微結(jié)構(gòu);RT-PCR法檢測MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡxmRNA和MyHCⅡbmRNA表達(dá);Western-blot法檢測細(xì)胞MyHC、COXⅣ、Mfn1、OPA1、Drp1、MnSOD、PGC-1α、AMPK、p-AMPK(Thr172)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)和p21蛋白表達(dá)量;2)用低濃度馬血清誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞分化,分別在成肌分化后0h,3h,6h,9h,12h和24h終止分化,收集細(xì)胞,測定成

6、肌分化及線粒體重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)(同前);3)建立濃度梯度H2O2干預(yù)C2C12成肌細(xì)胞分化模型,MTT法檢測細(xì)胞存活率,RT-PCR法檢測MyHCmRNA表達(dá),確定促進(jìn)成肌分化的低濃度H2O2和抑制成肌分化的高濃度H2O2。在C2C12成肌細(xì)胞分化起始時(shí)分別加入高或低濃度H2O2,分化24h后檢測成肌分化及線粒體重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)(同前)。并在低濃度H2O2干預(yù)模型中加入雷帕霉素,在高濃度H2O2干預(yù)模型中加入亮氨酸,檢測mTOR在ROS調(diào)控成肌

7、分化通路中的角色。
　　結(jié)果：
　　一、運(yùn)動(dòng)和衰老對肌衛(wèi)星細(xì)胞分化中線粒體重構(gòu)和ROS生成的影響
　　本部分研究中,與青年組比較,老年組肌肉濕重/體重比值和肌纖維橫截面積明顯降低,表明衰老性肌萎縮模型建立成功。老年組衛(wèi)星細(xì)胞體外分化24h后,肌管形成數(shù)量、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡxmRNA及MyHC蛋白表達(dá)均低于青年組,提示衰老衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化能力降低。此外,老年組ST3、RCR、MnSOD、COXⅣ、Mf

8、n1、L-OPA1、S-OPA1、Drp1、PGC-1α、Tfam、mTOR、p-mTOR、p21表達(dá)均顯著降低;老年組ST4、細(xì)胞ROS水平、線粒體ROS生成速率、p-AMPK顯著升高。電鏡結(jié)果顯示,老年組線粒體嵴數(shù)量極少且排列紊亂。12周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練部分逆轉(zhuǎn)了上述衰老對成肌分化、ROS生成、線粒體能量代謝、生物合成、融合分裂及嵴重構(gòu)的影響。
　　二、C2C12成肌細(xì)胞分化進(jìn)程中線粒體重構(gòu)與ROS生成動(dòng)態(tài)變化
　　本部分研究中

9、,分化3h時(shí),MyHC、ST3、RCR、ATP合成活力、膜電位、細(xì)胞ROS、線粒體ROS生成速率、MnSOD、L-OPA1、Mfn1、PGC-1α、p-mTOR、p-AMPK和p21即開始顯著升高,且升高趨勢持續(xù)至24h。分化6h時(shí),S-OPA1和mTOR表達(dá)開始升高,且升高趨勢持續(xù)至24h。分化9h時(shí),Tfam表達(dá)開始升高,且升高趨勢持續(xù)至24h。ST4在分化12h和24h時(shí)開始升高。COXⅣ在分化24h時(shí)才開始明顯升高。Drp1在分

10、化6h和9h時(shí)顯著升高,但在12h時(shí)開始降低,至24h時(shí)恢復(fù)至0h水平。
　　三、外源性H2O2對C2C12成肌細(xì)胞分化中線粒體重構(gòu)的調(diào)控機(jī)制研究
　　在濃度梯度H2O2干預(yù)C2C12成肌細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中,與0μmol/LH2O2比較,100μmol/LH2O2對細(xì)胞存活率無影響,MyHCmRNA表達(dá)升高了31％;600μmol/LH2O2使細(xì)胞存活率降低了18%,MyHCmRNA表達(dá)降低了28%。我們將100μMH2O2定義

11、促成肌分化的低水平ROS,將600μMH2O2定義抑制成肌分化的高水平ROS。進(jìn)一步研究表明,與0μmol/LH2O2比較,100μMH2O2使成肌分化、線粒體呼吸速率、ATP合成、膜電位、生物合成、融合分裂、嵴重構(gòu)均顯著上調(diào),加入雷帕霉素抑制甚至逆轉(zhuǎn)了100μMH2O2對成肌分化和線粒體重構(gòu)的促進(jìn)作用;600μMH2O2使成肌分化、線粒體呼吸速率、ATP合成、膜電位、生物合成、融合、嵴重構(gòu)均顯著下調(diào),加入亮氨酸部分恢復(fù)了600μMH2

12、O2對成肌分化和線粒體重構(gòu)的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可通過上調(diào)mTOR和PGC-1α表達(dá),促進(jìn)衰老衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中線粒體適應(yīng)性重構(gòu),包括線粒體嵴重構(gòu)趨向于成熟、線粒體空間結(jié)構(gòu)趨向于融合、線粒體生物合成增加。從而提高線粒體能量代謝水平,繼而通過抑制AMPK活化而增加p21表達(dá),從而促進(jìn)衰老衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化;并通過促進(jìn)MnSOD表達(dá),降低線粒體ROS水平;
　　2.成肌分化進(jìn)程中線粒體ROS持續(xù)性增加

13、。成肌分化中線粒體重構(gòu)的可能時(shí)序關(guān)系:①成肌分化起始時(shí),線粒體嵴重構(gòu)首先發(fā)生以促進(jìn)線粒體的成熟→②線粒體開始融合形成網(wǎng)絡(luò)→③線粒體開始分裂并從核周向細(xì)胞特定區(qū)域移動(dòng)再定位→④線粒體重新趨于融合→⑤線粒體生物合成開始。提示分化早期細(xì)胞能量水平與線粒體自身呼吸速率及空間構(gòu)象相關(guān),分化早期細(xì)胞能量水平與線粒體生物合成相關(guān);
　　3.低水平H2O2可通過活化mTOR和PGC-1α,促進(jìn)衰老衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中線粒體適應(yīng)性重構(gòu),包括線粒體嵴重