特殊表型Werner綜合征一例研究.pdf

1、Wemer綜合征（WS，OMIM catalog#277700）又名成人早老征，是1904年由Otto Werner首先報(bào)道，以過早衰老為特征性表現(xiàn)的一種罕見的常染色體隱性遺傳性(AR)疾病。本病被研究者認(rèn)為是“人類老化的天然基因模型”。
　　 WS臨床譜很廣，患者幼年身體和智力發(fā)育相對(duì)正常，10～18歲出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯，其臨床表現(xiàn)主要發(fā)生在4個(gè)系統(tǒng):結(jié)締組織受累發(fā)生率100％，出現(xiàn)年齡27±10歲，表現(xiàn)為特殊的面容和體形、皮膚硬化

2、、灰白或稀疏頭發(fā)、骨質(zhì)疏松、白內(nèi)障和透明質(zhì)酸尿等;內(nèi)分泌和代謝系統(tǒng)異常發(fā)生率80％，出現(xiàn)年齡36±9歲，表現(xiàn)為糖尿病、性腺功能減退、甲狀腺功能異常、高脂血癥等;免疫系統(tǒng)受累發(fā)生率80％，出現(xiàn)年齡40±10歲，表現(xiàn)為自身抗體產(chǎn)生導(dǎo)致自身免疫性疾病;神經(jīng)系統(tǒng)受累發(fā)生率50％，出現(xiàn)年齡40±10歲，表現(xiàn)為腦萎縮、老年性癡呆和精神分裂癥等。其中皮膚潰瘍出現(xiàn)年齡34.7±9.6歲?；颊咂骄鶋勖鼮?4歲，約50％的患者死于惡性腫瘤或者由于動(dòng)脈粥樣硬

3、化所致心肌梗死或腦梗死而死亡。本病罕見，通過清華同方CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索國(guó)內(nèi)2010年之前的期刊文獻(xiàn)共有10例病例報(bào)道，于1983年首例報(bào)道。全世界1916-2002年總共報(bào)道1300例，其中日本報(bào)道1000余例，以日本的近親聯(lián)姻后代中的WS患者發(fā)病率較高，日本發(fā)病率達(dá)1/10萬(wàn)，而其他地區(qū)為1/100萬(wàn)～1/1000萬(wàn)。近十年內(nèi)可以查詢到完整資料的7例患者中有1例兒童及6例成人，其中父母為近親結(jié)婚者2例，患者家族中有類似患者的有2例，兒

4、童患者以不能下蹲就診，6例成人患者均患有白內(nèi)障，其中5例以足部潰瘍就診，1例以腦膜瘤引起左面部麻木就診。本例患者無典型WS患者所具有的雙側(cè)白內(nèi)障，而僅患有翼狀胬肉，雙眼虹膜萎縮等，且無伴發(fā)常見的糖尿病，伴有神經(jīng)性耳聾，屬于罕見類型。查閱國(guó)外文獻(xiàn)，僅法國(guó)學(xué)者Uhrhammer等研究論文中有1例無白內(nèi)障，伴有聽力下降擬診的WS患者。伴有神經(jīng)性耳聾WS病例在國(guó)內(nèi)屬首次報(bào)道。
　　 WS國(guó)際注冊(cè)網(wǎng)站提供的診斷標(biāo)準(zhǔn)如下:主征:（10歲以后

5、發(fā)生）①白內(nèi)障（雙眼）;②典型皮膚病變（皮膚變薄，硬化，色素樣改變，潰瘍，過度角化，局部皮下萎縮）“小鳥”樣面容;③身材矮小;④雙親近親婚配史（三代以內(nèi)表親）或受累同胞;⑤早老和/或禿發(fā);⑥24小時(shí)尿玻璃酸試驗(yàn)陽(yáng)性。次征:①糖尿病;②性腺機(jī)能減退（第二性征缺如，不育，睪丸或卵巢萎縮）;⑨骨質(zhì)疏松;④肢端骨樣硬化（X光片）:⑤軟組織鈣化:⑥早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的證據(jù)（如:心梗史）;⑦間質(zhì)腫瘤;⑧聲音改變（聲嘶，聲銳）;⑨扁平足。確診:所有主征

6、加兩個(gè)次征。擬診:前三個(gè)主征加兩個(gè)其他條件。疑診:白內(nèi)障或皮膚病變加其他四個(gè)條件。排除:青春期前即出現(xiàn)相應(yīng)癥狀，體征（身材矮小除外）。本病主要與以下幾種皮膚衰老和或伴有耳聾及網(wǎng)狀色素沉著等表現(xiàn)的疾病相鑒別診斷:系統(tǒng)性硬皮病、肢端老化癥、核纖層蛋白?。òㄔ缋习Y、下頜骨肢端發(fā)育不良、非典型WS、伴有類早老表現(xiàn)的早發(fā)型肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥等）、變形性早老癥、Rothmund-Thomson綜合征、Bloom綜合征、KID綜合征、Cockayne綜

7、合征、共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、先天性角化不良等。
　　 本病臨床譜很廣，伴感音性神經(jīng)性耳聾特殊類型的Werner綜合征更為罕見，該病基因型與表現(xiàn)型的關(guān)系尚不甚明確。WRN致病基因定位于8p11.1-p12.1，全長(zhǎng)5.2kb，包含35個(gè)外顯子，編碼1432個(gè)氨基酸。http://www.pathology.washington.edu/research/werner/database/數(shù)據(jù)庫(kù)目前已發(fā)現(xiàn)WRN基因突變位點(diǎn)有85個(gè)

8、之多，包括堿基替換、缺失、插入及非同義SNP等，30個(gè)外顯子的編碼區(qū)和剪接位點(diǎn)均有突變基因的發(fā)現(xiàn)。雙等位基因突變大約占90％，最常見的突變類型是c.1105C＞T，在歐洲和日本占20％-25％。國(guó)內(nèi)學(xué)者Zhao等報(bào)道1例31歲男性患者，伴有白內(nèi)障，尚無糖尿病，DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)一新WRN基因突變25號(hào)外顯子c.3250delG，導(dǎo)致合成蛋白縮短，從而降低了解旋酶的活性。郝淑煜等報(bào)道1例伴發(fā)腦膜瘤患者，發(fā)現(xiàn)18號(hào)外顯子c.2806insA，為

9、一新雜合突變。臺(tái)灣學(xué)者Yeong等報(bào)道2例26、28歲的親姐妹患者，伴有白內(nèi)障，尚無糖尿病，DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)WRN基因突變3264-5delAG。查閱國(guó)外文獻(xiàn)，僅法國(guó)學(xué)者Uhrhammer等研究論文中有1例無白內(nèi)障，伴有聽力下降擬診的WS患者，該患者WRN基因突變?yōu)閏.3496A＞T，導(dǎo)致p.Lys1166＞X。伴神經(jīng)性耳聾Werner綜合征的基因突變研究在國(guó)內(nèi)尚屬首次。
　　 WRN蛋白是DNA解旋酶RecQ家族成員之一。人類保

10、守RecQ家族還包括RecQ1，BLOOM綜合癥的蛋白(BLM)，Rothmund-Thomson綜合癥的蛋白R(shí)ecQ4，和RecQ5。3個(gè)RecQ解旋酶家族的缺陷，包括RecQ4，BLM和WRN(RecQ2)，可以導(dǎo)致人類腫瘤易感性和過早老化的病理學(xué)變化。WRⅣ基因突變導(dǎo)致沃納綜合征。WRN是最有特征性的RecQ解旋酶家族成員，包括RecQ解螺旋結(jié)構(gòu)域和N端的核酸酶結(jié)構(gòu)域等，既有解旋酶活性，又有核酸外切酶活性。已知的功能包括參與DNA

11、復(fù)制和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、染色體端粒的維護(hù)等。體外和體內(nèi)研究都表明，WRN的功能通過翻譯后修飾以及一些重要的蛋白質(zhì)之間的相互作用來表現(xiàn)，其功能障礙可導(dǎo)致體細(xì)胞中基因組不穩(wěn)定狀態(tài)。
　　 Werner綜合征的基因型和表現(xiàn)型間的關(guān)系復(fù)雜，具有遺傳異質(zhì)性。建議患者保持良好的生活習(xí)慣，定期檢查，防治可能發(fā)生的并發(fā)癥如動(dòng)脈粥樣硬化及各種惡性腫瘤等。目前大多數(shù)遺傳病無法治愈，通過研究希望為今后的遺傳疾病的診斷和治療提供有益參考。
　　 目的

12、:
　　 1.分析該病的組織起源、臨床表現(xiàn)、鑒別診斷、治療方法及預(yù)后等，提高對(duì)國(guó)內(nèi)首例特殊表型Werner綜合征的認(rèn)識(shí)。
　　 2.建立一種簡(jiǎn)單快速的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)方法分析WRN基因突變，初步探討本例Werner綜合征的分子病因及發(fā)病機(jī)制。
　　 資料與方法:患者及家屬簽署知情同意書，臨床及試驗(yàn)研究符合《赫爾辛基宣言》。1.收集本例患者詳細(xì)臨床資料，完善各系統(tǒng)篩查、實(shí)驗(yàn)室檢查，復(fù)習(xí)文獻(xiàn)資料，完成臨床診斷和鑒別

13、診斷，附病例報(bào)告:
　　 患者男，38歲，未婚。雙足多發(fā)性潰瘍，疼痛半年。本例患者臨床特點(diǎn)如下:①中年男性，青春期前后發(fā)病。②主要臨床表現(xiàn)為足部多發(fā)性皮膚潰瘍遷延不愈，身材矮小消瘦，皮膚皮革樣硬化，白發(fā)。③8年前曾行左足潰瘍植皮術(shù)，近年來雙耳聽力下降，嗓音細(xì)高，輕度聲嘶。④體格檢查:可見大量白發(fā)，面部皮下脂肪萎縮呈“小鳥樣”面容，假性眼球突出，右眼內(nèi)眥結(jié)膜處可見白色翼狀胬肉，鼻口皮膚縮窄呈喙?fàn)畋?，口周放射狀溝紋，牙列不齊并突出，

14、無胡須及喉結(jié)。肩胛帶，骨盆帶，四肢皮下脂肪，肌肉萎縮硬化，呈皮革狀不能捏起。雙足背，足跟踝處多處潰瘍，表面結(jié)痂，扁平足。外生殖器陰莖陰囊幼稚未發(fā)育，未見陰毛腋毛。全身皮膚干燥，頸部皮膚彌漫性網(wǎng)狀色素沉著，雙下肢伸側(cè)色素沉著，類似魚鱗病樣斑片狀皮損，少量脫屑。⑤實(shí)驗(yàn)室檢查:睪酮(T):0.382 ng/mL僅為男性7～12歲水平;腹部B超:前列腺測(cè)值小;骨密度測(cè)定:骨質(zhì)疏松;電測(cè)聽:雙側(cè)中重度感音性神經(jīng)性耳聾;淚腺分泌試驗(yàn):左1 mm/m

15、in，右3mm/min（干眼癥）。綜上，患者具有特征性的“小鳥樣”面容;皮膚老齡化改變，白發(fā)是早老的表現(xiàn);肩胛帶，骨盆帶，四肢皮下脂肪，肌肉萎縮硬化，呈皮革狀不能捏起，呈硬皮病樣皮膚改變:無胡須及喉結(jié)，外生殖器幼稚，未見陰毛腋毛，伴有睪酮水平低下及骨質(zhì)疏松等內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)異常。Goto等在2000年修訂了WS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，具體為35歲以下，出現(xiàn)以下5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的4項(xiàng)即可明確診斷。①近親結(jié)婚;②特征性的鳥形或面具形臉和體型;③早老特征;④硬

16、皮病樣皮膚表現(xiàn);⑤內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)異常。本病例符合后4條，臨床診斷為Werner綜合征。患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜，伴有神經(jīng)性耳聾，聲嘶，右眼翼狀胬肉，雙眼虹膜萎縮，淚腺分泌功能下降，扁平足而無糖尿病及白內(nèi)障，擬診為一新型伴神經(jīng)性耳聾Werner綜合征。
　　 2.收集本例患者及3例正常同齡健康對(duì)照皮膚組織，收集患者及其家屬、正常健康對(duì)照30例靜脈血標(biāo)本。
　　 3.WRN基因突變篩查建立簡(jiǎn)單快速的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

17、方法分析WRN基因突變，原理是:提取血液細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后采用ABI.PRISM3700自動(dòng)測(cè)序儀直接測(cè)序。利用Chromas軟件（2.23版本）和Clustalx軟件分析測(cè)序結(jié)果與WRN基因的cDNA序列（GenBank登錄號(hào):NM000553.4）進(jìn)行比對(duì)以發(fā)現(xiàn)可能突變位點(diǎn)。提取血液細(xì)胞中DNA，對(duì)于發(fā)現(xiàn)的可疑突變位點(diǎn)

18、的所在外顯子進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并合成，通過普通聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法進(jìn)行擴(kuò)增，然后采用3730XL型DNA測(cè)序儀直接測(cè)序。利用Chromas軟件（2.23版本）和Clustalx軟件分析測(cè)序結(jié)果與WRN基因的DNA序列(GenBank登錄號(hào):NC000008.9)進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證突變位點(diǎn)。具體步驟如下:
　　 3.1外周血總RNA提取及cDNA測(cè)序
　　 3.1.1對(duì)患者及其家屬2份抗凝靜脈血樣品RNA抽提3.1.2反轉(zhuǎn)錄3

19、.1.3引物設(shè)計(jì)合成3.1.4 PCR體系優(yōu)化并擴(kuò)增3.1.5 PCR產(chǎn)物純化3.1.6 PCR純化產(chǎn)物測(cè)序3.2外周血DNA提取及DNA測(cè)序驗(yàn)證:
　　 3.2.1患者及其家屬2份及30份正常健康對(duì)照抗凝靜脈血樣品DNA抽提3.2.2引物設(shè)計(jì)合成3.2.3 PCR體系優(yōu)化并擴(kuò)增3.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序4.生物信息學(xué)分析驗(yàn)證通過互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)（如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi;ht

20、tp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank等），進(jìn)行序列比對(duì)分析試驗(yàn)結(jié)果。
　　 5.熒光定量PCR檢測(cè)分析對(duì)患者及3例正常同齡健康對(duì)照皮膚組織樣品做RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄，PCR體系優(yōu)化，PCR擴(kuò)增及測(cè)序，以GapDH為內(nèi)參，檢測(cè)WRN基因的mRNA表達(dá)量，試驗(yàn)重復(fù)三次，得到一致結(jié)果。
　　 5.1確定基因序列和目標(biāo)種屬5.2設(shè)計(jì)合成引物5.3提取皮膚組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

21、
　　 5.4構(gòu)建2個(gè)基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品5.5繪制2個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線5.6對(duì)3個(gè)樣本2個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行SYBR法qPCR檢測(cè)5.7數(shù)據(jù)分析6.免疫組化法檢測(cè)WRN蛋白表達(dá)以免疫組化法檢測(cè)患者及3例正常同齡健康對(duì)照皮膚組織樣品的WRN蛋白表達(dá)，試驗(yàn)重復(fù)三次，得到一致結(jié)果。
　　 結(jié)果:
　　 1.本例患者符合Goto修改的WS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，除此外伴有神經(jīng)性耳聾，右眼翼狀胬肉，雙眼虹膜萎縮，淚腺分泌功能下降等，而無糖尿病

22、及白內(nèi)障，臨床診斷為一新型伴神經(jīng)性耳聾Werner綜合征，為國(guó)內(nèi)首報(bào)。
　　 2.使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)成功對(duì)國(guó)內(nèi)首例新型Werner綜合征進(jìn)行基因突變分析，分析WRN基因的cDNA測(cè)序結(jié)果以及DNA測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，患者WRN基因有4處堿基改變:exon20 c.2361 G＞T和exon27 c.3237 G＞A、內(nèi)含子2967+237A＞G和3309+26 C＞T。這些變異是人群中存在的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中外顯子

23、cSNP在國(guó)外已有報(bào)道。
　　 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:患者皮膚組織中WRN的表達(dá)量與正常同齡健康對(duì)照相當(dāng)?；颊遅RN基因在mRNA水平上沒有發(fā)生明顯變化。
　　 4.免疫組化檢測(cè)患者皮膚組織WRN蛋白表達(dá)，與正常同齡健康對(duì)照未發(fā)現(xiàn)表達(dá)明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.發(fā)現(xiàn)并臨床診斷國(guó)內(nèi)首例伴神經(jīng)性耳聾且無糖尿病及白內(nèi)障Werner綜合征。WS極為罕見，臨床譜很廣，表現(xiàn)多樣，本例特殊表型的Wer

24、ner綜合征的臨床研究報(bào)道豐富了國(guó)內(nèi)遺傳性皮膚病資源。
　　 2.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)可以簡(jiǎn)單快速地檢測(cè)分析WRN基因突變，可大大節(jié)約基因突變檢測(cè)費(fèi)用成本，值得在臨床已知單基因遺傳病基因突變驗(yàn)證分析試驗(yàn)中推廣使用。
　　 3.本例Werner綜合征未發(fā)現(xiàn)WRN基因外顯子的致病性突變，進(jìn)一步證實(shí)Werner綜合征的基因型和表現(xiàn)型間的關(guān)系非常復(fù)雜，具有遺傳異質(zhì)性。
　　 4.研究本例患者皮膚組織，在mRNA水平和WRN