熒光素酶光成像適時監(jiān)測hTRAIL基因治療肺癌A549細胞裸鼠移植瘤的實驗研究.pdf

1、目的：以ad-hTRAIL、ad-luc和PBS作為對照，研究腫瘤內(nèi)直接注射腺病毒載體ad-luc-hTRAIL是否可以對A549細胞裸鼠移植瘤有治療作用；探討報告基因熒光素酶（luc）的表達是否可以反映病毒載體介導的治療基因人腫瘤壞死因子相關配體（hTRAIL）的表達情況，以及是否可以反映治療情況。
　　 方法：
　　 1建立肺癌A549細胞裸鼠移植瘤模型：常規(guī)方法體外培養(yǎng)肺癌A549細胞，收集細胞，消毒裸鼠背部皮膚，

2、皮下注射法建立移植瘤裸鼠動物模型。
　　 2抗腫瘤療效觀察：直接瘤內(nèi)多點注射腺病毒載體ad-luc-hTRAIL，對照組注射ad-hTRAIL、ad-luc、PBS。于不同時間點（治療開始后第4、7、10、14、21、28天）動態(tài)觀察各實驗組腫瘤生長情況，測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，計算抑瘤率。
　　 3熒光素酶活性檢測：基因治療開始后，于不同時間點利用高敏感、低溫CCD照相機進行生物發(fā)光光成像檢查，在活體上動態(tài)觀察

3、各組腫瘤部位的生物發(fā)光情況。
　　 4免疫組化法檢測hTRAIL蛋白表達情況：基因治療開始后，于不同時間點處死部分裸鼠取腫瘤組織，觀察ad-hTRAIL、adduc-hTRAIL、PBS組腫瘤組織中hTRAIL蛋白表達情況，并進行免疫組化評分（IHS）。
　　 5 TUNLE法檢測腫瘤細胞凋亡情況：基因治療開始后，于不同時間點處死部分裸鼠取腫瘤組織，觀察Ad-hTRAIL、Ad-luc-hTRAIL、PBS組腫瘤細胞凋亡

4、情況，并計算凋亡率。
　　 結果：成功建立A549細胞裸鼠移植瘤模型，成瘤率100％。hTRAIL能夠抑制移植瘤生長，基因治療開始后，含治療基因hTRAIL的ad-luc-hTRAIL與ad-hTRAIL組腫瘤生長速度明顯較不含治療基因的ad-luc組及PBS對照組緩慢，第4、7、10、14、21、28天兩組抑瘤率分別為30.20％、43.93％、52.02％、65.67％、55.37％、51.20％和34.20％、52.67％

5、、55.70％、58.53％、56.67％、57.50％。腫瘤體積組間比較顯示，ad-luc-hTRAIL組與ad-luc組及PBS組有統(tǒng)計學差異（P<0.05），ad-hTRAIL，組與ad-luc組及PBS組有統(tǒng)計學差異（P<0.05），ad-luc-hTRAIL、ad-hTRAIL兩組間無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.10）。生物發(fā)光成像結果顯示，含有l(wèi)uc報告基因的ad-luc組與ad-luc-hTRAIL組腫瘤部位于治療開始后都能夠

6、表達熒光素酶，ad-luc-hTRAIL組熒光素酶活性于治療第七天達高峰后明顯下降，ad-luc組在治療后第4～14天內(nèi)均保持較高水平表達，第21、28天熒光素酶活性略有下降。而ad-hTRAIL與PBS組整個實驗過程中無發(fā)光。免疫組化檢測hTRAIL蛋白，并進行免疫組化評分（IHS=陽性細胞數(shù)分級×顯色強度），ad-luc-hTRAIL與ad-hTRAIL組腫瘤組織中大量表達hTRAIL蛋白，于第7天達到高峰（IHS峰值分別為6.25

7、+/-2.06、6.5+/-2.887），以后隨時間延長表達量逐漸下降。TUNLE法檢測腫瘤組織內(nèi)凋亡情況顯示，ad-luchTRAIL與ad-hTRAIL組中可觀察到大量腫瘤細胞凋亡，兩組的凋亡率于治療后第7天達到高峰（峰值分別為60.75+/-8.06％、61.50+/-8.47％），以后隨時間延長逐漸下降。
　　 結論：
　　 1應用雙基因表達的ad-luc-hTRAIL載體可有效將目的基因轉導入肺癌A549細胞裸