血管基膜衍生多功能肽高效工程菌的構(gòu)建及人肺癌裸鼠移植瘤模型治療實(shí)驗(yàn).pdf

1、研究背景：本文采用整合抑制腫瘤血管生成和抑制腫瘤細(xì)胞增殖策略，將腫瘤抑素(tumstatin)N端74-98氨基酸功能肽通過人IgG3上游鉸鏈區(qū)序列與tumstatinN端197-215氨基酸功能肽連接，獲得了一種全新的同時(shí)具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞增殖兩種不同抗腫瘤特性的血管基膜衍生多功能肽(Vascularbasementmembrane-derivedmultifunctionalpeptide，VBMDMP)。本課題

2、是在此基礎(chǔ)上構(gòu)建重組VBMDMP同型四聚體可溶性融合蛋白高豐度原核表達(dá)質(zhì)粒pETSUMO-4VBMDMP，轉(zhuǎn)化入BL21(ED3)大腸桿菌獲得重組VBMDMP高效工程菌；通過重組VBMDMP裸鼠人肺癌異種移植瘤模型治療實(shí)驗(yàn)評價(jià)重組VBMDMP治療腫瘤的有效性.為重組VBMDMP產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ). 方法：將原pUC19-VBMDMP和pUC19質(zhì)粒分別用HindⅢ和KpnⅠ酶切獲得VBMDMPcDNA片段和pUC19cDNA片段，將

3、兩者連接后得到新單聚體pUC19-VBMDMP；酶切圖譜和測序鑒定后，將新單聚體pUC19-VBMDMP用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切獲得VBMDMPcDNA片段，用BclⅠ和EcoRⅠ酶切獲得載體cDNA片段，將分別獲得的兩個(gè)片斷連接得到pUC19-2VBMDMP，重復(fù)以上步驟得pUC19-4VBMDMP；分別酶切圖譜和測序鑒定pUC19-2VBMDMP和pUC19-4VBMDMP。測序后以pUC19-4VBMDMP為模板，T/A克隆構(gòu)

4、建重組pETSUMO-4VBMDMP。重組pETSUMO-4VBMDMP原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(ED3)大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，鎳親和層析柱分離純化，得重組4VBMDMP融合蛋白。同時(shí)，用針對tumstatinN端197-215氨基酸功能肽的多克隆抗體，Westernblot分析對重組4VBMDMP進(jìn)行免疫鑒定。BCA法分別測定pETSUMO-4VBMDMP轉(zhuǎn)化的BL21(ED3)大腸桿菌裂解液和鎳親和層析后獲取的等容積洗

5、脫液蛋白質(zhì)含量，評價(jià)pETSUMO-4VBMDMP轉(zhuǎn)化的BL21(ED3)大腸桿菌生產(chǎn)重組VBMDMP的效率。最后應(yīng)用裸鼠人肺癌異種移植瘤模型治療實(shí)驗(yàn)鑒定重組VBMDMP抗腫瘤活性。　　結(jié)果： (1)VBMDMP單聚體，二聚體，四聚體的PCR產(chǎn)物和新單聚體pUC19-VBMDMP、pUC19-2VBMDMP、pUC19-4VBMDMP經(jīng)酶切圖譜和測序分析其序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。　　(2)pETSUMO-4VBMDMP轉(zhuǎn)化的

6、BL21(DE3)大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)，細(xì)胞裂解液和鎳親和層析柱洗脫液SDS-PAGE和Westernbolt顯示43KD的目的條帶，即重組4VBMDMP?！　?3)pETSUMO-4VBMDMP轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)大腸桿菌裂解液所含總蛋白量為5.45mg/ml，而鎳親和層析柱洗脫液重組4VBMDMP蛋白含量為2.56mg/ml，該轉(zhuǎn)化菌表達(dá)豐度為47％；該轉(zhuǎn)化菌的生產(chǎn)效率是原pGEX-4T-1-VBMDMP轉(zhuǎn)化JM109

7、大腸桿菌生產(chǎn)效率的9.8倍?！　?4)在裸鼠人肺癌異種移植瘤模型治療實(shí)驗(yàn)中，重組VBMDMP(1mg/kg，5mg/kg)的腫瘤生長抑制率分別是42％和74％，瘤重抑制率分別是42％和77％；其效價(jià)強(qiáng)度是常規(guī)化療藥環(huán)磷酰胺的20倍。這些結(jié)果表明重組VBMDMP對裸鼠人肺癌異種移植瘤生長具有顯著抑制作用?！　〗Y(jié)論：　　(1)成功地構(gòu)建重組VBMDMP同型四聚體可溶性融合蛋白高豐度原核表達(dá)質(zhì)粒pETSUMO-4VBMDMP?！　?2