蛋白激酶A對膀胱移行細胞癌的生物學(xué)調(diào)控.pdf

1、膀胱癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤，通常采用經(jīng)尿道電切術(shù)或膀胱部分切除術(shù)進行治療，具有較高的復(fù)發(fā)率，術(shù)后常規(guī)進行膀胱灌注和膀胱鏡隨訪是膀胱癌治療過程中不可分割的一部分。目前，膀胱癌的發(fā)生機制尚 不明確。 真核細胞的分裂和增殖依賴于細胞周期的精確調(diào)控，腫瘤細胞參與調(diào)控細胞周期的基因發(fā)生突變，使細胞分裂失去正常的調(diào)控。生長因子及其受體參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖，是研究最多的膀胱腫瘤標(biāo)記物，其中包括表皮生長因子及其受體，胰島素樣生長因子及

2、其受體，血管內(nèi)皮生長因子及其受體，轉(zhuǎn)化生長因子及其受體等。上述標(biāo)記物在膀胱移行細胞癌中高表達，參與調(diào)節(jié)腫瘤的新陳代謝和增殖，并與分期、分級和預(yù)后相關(guān)。 目前對于生長因子及其受體的信號傳導(dǎo)通路的下游研究較少，而位于其下游的蛋白激酶對于信號的傳導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用，是信號傳導(dǎo)鏈條中的軸心部分，通過蛋白激酶激活其它具有生物學(xué)活性的酶，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞新陳代謝和增殖的作用。細胞因子及其受體對細胞新陳代謝和增殖的調(diào)節(jié)歸根結(jié)底要靠蛋白激酶的激活

3、來完成。因此，研究蛋白激酶對于了解生長因子及其受體的作用機制具有重要意義。 目前認(rèn)為外界因素對細胞分裂主要有兩個調(diào)控點(restriction point)：一是處于G<,1>/S轉(zhuǎn)折點，控制細胞從靜止?fàn)顟B(tài)(G<,1>期)進入DNA合成期(S期)；另一調(diào)控點處于G<,2>/M轉(zhuǎn)折點，是決定細胞一分為二的控制點。非增殖狀態(tài)的細胞處于G<,o>期，在某些刺激因素如生長因子的誘導(dǎo)下，細胞由G<,o>期進入S期。 PKA是第二信

4、使cAMP依賴的蛋白激酶，是細胞內(nèi)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上重要的激酶，參與調(diào)節(jié)細胞的分化和增殖、離子轉(zhuǎn)運、新陳代謝的調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄等過程。PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是由受體、GTP結(jié)合蛋白(GTP bindingprotein和腺苷酸環(huán)化酶(AC)偶聯(lián)構(gòu)成。根據(jù)與C亞基結(jié)合的調(diào)節(jié)亞基的類型分為APK全酶I型和II型。其中，I型與細胞惡變關(guān)系密切，參與許多生長因子對細胞有絲分裂的調(diào)節(jié)過程。II型主要分布于正常組織，阻止有絲分裂信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制細胞的生

5、長。很多學(xué)者認(rèn)為提高PKA活性能夠抑制細胞增殖，與cylinD表達下降相關(guān)，而抑制PKA活性能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，還與腫瘤的化療和放療的敏感性相關(guān)，但目前尚無PKA活性變化對膀胱癌細胞凋亡影響的報導(dǎo)。 本研究旨在揭示PICA RIa在膀胱移行細胞癌中的表達與腫瘤分期、分級和預(yù)后的關(guān)系；探討PKA活性變化對膀胱癌細胞株T24增殖的影響以及其中可能存在的相關(guān)機制。研究PKA活性變化對腫瘤增殖的影響，從細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路水平揭示膀胱腫瘤發(fā)

6、生和凋亡的機制，對將來治療膀胱腫瘤意義重大。 方法 1．組織部分：用Western blot方法檢測PICA RIa在膀胱癌移行細胞癌中的表達強度(定量)，并分析其與膀胱癌分期、分級和預(yù)后的關(guān)系。 2．細胞部分：分別用PKA信號傳導(dǎo)通路的激動劑forskolin和抑制劑處理T24細胞后，用放免法檢測T24細胞中PKA活性的變化；用MTT法檢測T24細胞活力的變化；用流式細胞儀檢測細胞周期分布的變化。用Weste

7、rnblot檢測forskolin．作用下T24細胞中cyclinD<,1>表達的變化及H-89作用下T24細胞中Bcl-2表達的變化。 結(jié)果 PKA RIa在腫瘤組織中的表達顯著高于癌旁組織，G<,2>和G<,3>級的表達強度顯著高于G<,1>,G<,2>和G<,3>之間未見顯著差異；在浸潤型膀胱癌中的表達顯著高于淺表型膀胱癌。PICA RIa高表達組預(yù)后較低表達組差。forskohn能夠使T24細胞中的PKA活性增高

8、，并顯著降低細胞活力。在20umol/L forskohn作用24小時后，流式細胞儀檢測可見T24細胞增殖受到抑制，細胞處于G<,1>期靜止?fàn)顟B(tài)。用20umol/L forskolin誘導(dǎo)T24細胞后，eyclinD<,l>表達呈下降趨勢。H-89能夠使T24細胞中的PKA活性下降，并顯著降低細胞活力。在30μmol/LH-89作用，36小時后，流式細胞儀檢測可見T24細胞出現(xiàn)明顯的細胞凋亡。用15μmol/L H-89誘導(dǎo)。T24細胞

9、后，Bcl-2表達呈下降趨勢。 結(jié)論 1．PKA Riα表達強度與膀胱癌的分期、分級和預(yù)后關(guān)系密切，有可能作為膀胱癌的腫瘤標(biāo)記物。 2．Forskolin能夠顯著上調(diào)T24細胞中PKA的活性，PKA活性增高使T24細胞處于G<,1>期靜止，抑制其增殖，并顯著降低細胞活力。PKA活性增高所致的G<,1>期靜止可能與cyclinD<,1>的表達下降有關(guān)。 3．H-89能夠顯著下調(diào)T24細胞中PKA的活性，使T