CCL2在白血病細(xì)胞中的生物學(xué)作用的研究.pdf

1、第一部分CCL2基因慢病毒載體的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建趨化因子配體2（chemokine(C-C motif) ligand2，CCL2）基因的慢病毒表達(dá)載體，為研究該基因?qū)Π籽〖?xì)胞的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1.利用聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）技術(shù)，擴(kuò)增出 CCL2基因的CDS區(qū)，與pMD19載體進(jìn)行連接，陽(yáng)性克隆送至公司測(cè)序。2.利用基因重組技術(shù)構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒CCL2-PLVX，利用PLVX、PLP-VSVG、pl

2、p1、plp2慢病毒質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，在293T細(xì)胞中采用磷酸鈣沉淀法包裝CCL2慢病毒后侵染THP-1細(xì)胞，提取基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增CCL2基因。
　　結(jié)果：所獲 CCL2基因經(jīng)測(cè)序與 GenBank比對(duì)序列一致。慢病毒載體質(zhì)粒CCL2-PLVX經(jīng)雙酶切鑒定片段大小正確。包裝的慢病毒顆粒侵染 THP-1細(xì)胞后，CCL2基因成功插入細(xì)胞基因組DNA中。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建帶有CCL2基因的慢病毒載體，為進(jìn)一步研究CCL

3、2基因?qū)Π籽〖?xì)胞的生物學(xué)作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二部分 CCL2基因在白血病細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)及其生物學(xué)功能研究
　　目的：CCL2在白血病細(xì)胞株THP-1穩(wěn)定表達(dá)后，觀察CCL2對(duì)THP-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、細(xì)胞周期及細(xì)胞耐藥性的影響，初步探討CCL2基因在白血病細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
　　方法：將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成三組：未轉(zhuǎn)染組，空載體轉(zhuǎn)染組以及CCL2轉(zhuǎn)染組。1.CCK-8試劑測(cè)定細(xì)胞活力，繪制生長(zhǎng)曲線，觀察CCL

4、2對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響；2.利用FCM檢測(cè)CCL2對(duì)THP-1細(xì)胞周期的影響3.用2種化療藥物(柔紅霉素、高三尖杉酯堿)作用THP-1細(xì)胞24h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，觀察CCL2基因?qū)λ幬锩舾行缘挠绊懀?.加入100ng/ml濃度的CCL2重組蛋白，觀察CCL2對(duì)THP-1的趨化作用；利用 Transwell小室觀察三組細(xì)胞的遷移和侵襲能力。5.收集侵襲實(shí)驗(yàn)中上下室的培養(yǎng)上清，Elisa檢測(cè)CCL2蛋白濃度。6.不加/加入1

5、00ng/ml濃度的CCL2重組蛋白處理THP-1細(xì)胞24h，收集細(xì)胞做遷移RT2 profiler PCR array實(shí)驗(yàn)，初步探討CCL2影響遷移的機(jī)制。
　　結(jié)果：1. CCK-8法繪制生長(zhǎng)曲線，CCL2轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組(空載體載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組，下同)的細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異（P＞0.05）；2.FCM檢測(cè)三組細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，CCL2的表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期無(wú)顯著影響（P>0.05）；3.加藥結(jié)果顯示，CCL2不影響THP-1細(xì)胞對(duì)柔紅

6、霉素、及高三尖杉酯堿的藥物敏感性；4.通過(guò)遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，CCL2重組蛋白可以增強(qiáng)THP-1細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力；CCL2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移能力與對(duì)照組無(wú)明顯差異(9.293±0.302 Vs9.187±0.526，p=0.77)，穿膜能力明顯低于對(duì)照組（1.702±0.537 Vs0.520±0.255，p=0.026）；5.侵襲實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染CCL2組上室CCL2蛋白濃度顯著高于下室（p<0.001）；6.遷移RT2 pro

7、filer PCR array顯示，CCL2重組蛋白處理THP-1細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，EPX、SPP1、CCL2、CX3CL1和CXCL13的表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論：。1.CCL2定向趨化 THP-1細(xì)胞的遷移，高表達(dá) CCL2的細(xì)胞通過(guò)自分泌樣作用使其侵襲能力減弱；2.CCL2的表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞的增殖、周期及藥物敏感性無(wú)顯著影響
　　第三部分 CCL2干擾對(duì)白血病細(xì)胞的生物學(xué)影響
　　目的：干擾CCL2在白血病細(xì)

8、胞株HL-60的表達(dá)后，觀察 CCL2基因?qū)L-60細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響及相關(guān)機(jī)制研究。
　　方法：1.利用慢病毒包裝的方法將干擾效率最高的RNA鏈侵染白血病細(xì)胞株HL-60，驗(yàn)證CCL2基因在RNA水平和蛋白水平的表達(dá)。2.將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成三組：未轉(zhuǎn)染組，空載體轉(zhuǎn)染組以及sh-CCL2轉(zhuǎn)染組，使用CCK-8試劑盒測(cè)定三組細(xì)胞活力，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察 sh-CCL2對(duì) HL-60細(xì)胞增殖的影響；2.通過(guò) FCM分析s

9、h-CCL2對(duì)HL-60細(xì)胞周期的影響；3.利用表達(dá)譜測(cè)序技術(shù)，分析CCL2基因穩(wěn)定沉默對(duì)HL-60細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。
　　結(jié)果:1.RT-PCR和Western Blot驗(yàn)證CCL2表達(dá)水平成功下調(diào)。2. CCK-8法繪制生長(zhǎng)曲線，sh-CCL2轉(zhuǎn)染組的增殖速度明顯低于對(duì)照組(空載體載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組，下同)(p<0.01)；2.我們采用 FCM檢測(cè)三組細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，sh-CCL2沉默后細(xì)胞S期含量減少12％，G1期含量增

10、加；3.測(cè)序結(jié)果顯示，CCL2穩(wěn)定沉默細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞間的差異表達(dá)基因共有159個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的基因58個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因101個(gè)，涉及細(xì)胞周期、TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、NOD樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、NF-κB信號(hào)通路等多個(gè)方面，RT-PCR和Western Blot驗(yàn)證CCL2沉默后，細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1的表達(dá)明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：1. RNAi沉默CCL2后，白血病細(xì)胞HL-60增殖速度明顯減慢；2.RNAi沉默CCL2干擾HL-60細(xì)胞

11、由G1期進(jìn)入S期，細(xì)胞內(nèi)cyclinD1的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)下降。
　　第四部分 CCL2/CCR2基因在急性白血病中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的:探討CCL2/CCR2基因在急性白血病(acute leukemia，AL)患者原代骨髓細(xì)胞中的表達(dá)情況及其與AL各項(xiàng)臨床特征的相關(guān)性及預(yù)后意義。
　　方法:病例來(lái)源于2012-2013年期間在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院診斷和治療的急性白血病患者176例(初診ALL66例

12、，ALL緩解60例，初診AML32例，AML緩解18例)，20例同期非急性白血病作為對(duì)照。采用患者的骨髓標(biāo)本分離單個(gè)核細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)CCL2和CCR2基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)合臨床資料，分析其在AL中的表達(dá)及其與臨床的相關(guān)性。
　　結(jié)果:1.CCL2及CCR2在疾病的不同病程階段表達(dá)水平不同。在ALL中，CCL2和 CCR2的表達(dá)趨勢(shì)一致，即初診組低水平，完全緩解后表達(dá)增高至正常

13、水平（PCCL2<0.001，PCCR2<0.001）。在AML中，初診組 CCL2的表達(dá)水平低于對(duì)照組（P<0.001），化療后CCL2的表達(dá)水平無(wú)改變（P=0.462）；CCR2在AML患者的表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)明顯差異（P>0.05）。2.初診AML患者CCL2和CCR2的表達(dá)水平高于初診 ALL患者（PCCL2=0.002，PCCR2<0.001）；3.CCL2的表達(dá)水平高低與 AL患者臨床特征及早期治療反應(yīng)均無(wú)明顯相關(guān)性。