GINS2在早幼粒細胞白血病發(fā)生中的作用及其分子機制研究.pdf

1、第一部分干擾GINS2表達對HL60細胞增殖和凋亡的影響
　　 目的:探討干擾GINS2基因表達后對人早幼粒細胞白血病細胞株HL60增殖和凋亡的影響及其機制。
　　 方法:RT-PCR分別檢測GINS2基因在3株白血病細胞株HL60、U937、THP-1中的表達量。設計并合成針對GINS2基因的靶向干擾序列，穩(wěn)定轉染高表達該基因的HL60細胞，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況;RT-PCR和Western blot分

2、別檢測各組細胞轉染后GINS2的mRNA及蛋白水平; MTT法檢測細胞的增殖和凋亡情況;流式細胞術分析細胞的凋亡率;Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達。
　　 結果:在3株白血病細胞株中，GINS2的表達量由低到高依次是:THP-1，U937，HL60。干擾質粒轉染HL60細胞后，與陰性對照組及未處理組相比，干擾組GINS2的mRNA及蛋白水平均顯著降低，且細胞的增殖能力明顯受抑。同時，凋亡相關蛋白 Bax表達水平顯

3、著增高而Bcl2顯著降低。
　　 結論:下調GINS2基因表達后，可通過上調Bax表達，下調Bcl2表達來抑制HL60細胞增殖并促進其凋亡。
　　 第二部分干擾GINS2表達對HL60細胞周期調控因子的變化及機制
　　 目的:觀察下調GINS2基因的表達后對人白血病細胞株HL60周期調控因子的變化并探討其機制。
　　 方法:脂質體介導并穩(wěn)定轉染干擾質粒的細胞為干擾組，轉染陰性對照質粒的細胞為陰性對照組，只

4、加入脂質體的細胞為空白對照組，未轉染的HL60細胞為未處理組。采用集落形成實驗測定細胞的增殖水平;流式細胞術分析各組細胞周期;Western blot檢測CDK1、CyclinB1等周期調控蛋白的變化;同時采用RT-PCR檢測ATM，CHK2，P53等周期調控因子mRNA水平的表達;Western blot檢測其蛋白水平的表達情況。
　　 結果:和其他3組相比，干擾組細胞G2/M期細胞數(shù)明顯增加且DNA合成受阻，增殖減慢。與G2

5、/M期相關周期調控蛋白CDK1，cyclinB1的表達隨時間變化而明顯降低。RT-PCR和western blot均顯示和其他三組相比，干擾組細胞ATM，CHK2，P53轉錄水平和翻譯水平顯著上調。
　　 結論:下調GINS2表達后可抑制HL60細胞DNA復制并影響其G2/M期進程，機制可能與ATM，CHK2，P53等基因有關。
　　 第三部分攜人GINS2基因重組腺病毒載體的構建及其對HL60細增殖和凋亡的影響

6、　　 目的:使用AdEasy系統(tǒng)構建攜帶GINS2基因的重組腺病毒載體并進行鑒定，觀察上調GINS2表達對HL60細胞增殖及凋亡的影響。
　　 方法:以pcDNA3.1-GINS2質粒作為模版，RT-PCR法擴增GINS2基因編碼序列全長并克隆入穿梭載體pAdTrace-TO4，經(jīng)轉化、酶切和測序正確后，將產生的重組質粒pAdT-GINS2轉化入pAdEasy-1-B J5183感受態(tài)進行同源重組，得到重組子pAdE-GINS

7、2。后將其轉染HEK293細胞進行包裝，行PCR和熒光顯微鏡鑒定重組腺病毒Ad-GINS2。待擴增測定滴度后感染人HL60細胞，MTT法檢測重組腺病毒感染后HL60細胞的生長情況，集落形成實驗測定細胞的增殖情況，流式細胞術檢測凋亡細胞個數(shù)，PCR和western blot法分別檢測凋亡蛋白Bax，Bcl2的變化情況。
　　 結果:酶切、PCR、測序結果顯示GINS2基因克隆入穿梭質粒，并得到重組腺病毒Ad-GINS2; PCR法

8、和熒光顯微鏡顯示包裝成功;經(jīng)三輪高效擴增病毒后病毒滴度達1.35×1012 IU/ml，感染HL60細胞后，western blot可檢測到GINS2的表達，MTT和集落形成實驗結果均表明GINS2過表達后能促進細胞增殖，流式細胞術顯示病毒感染細胞后凋亡率明顯降低，Western blot顯示凋亡蛋白Bax顯著降低而Bcl2顯著升高。
　　 結論:成功構建包含GINS2基因的重組腺病毒載體，可通過上調Bcl2表達而抑制Bax表達