Myroilysin脫細胞異種神經復合人牙髓前體細胞的神經移植物生物學特性研究.pdf

1、周圍神經損傷因可能造成機體感覺和運動功能的部分或全部喪失，從而嚴重影響機體的功能行使和生活質量，其修復再生一直備受關注。利用組織工程學的原理和方法制備人工神經以修復周圍神經缺損是這一研究領域的熱點。本課題正是基于此欲構建一種新型的組織工程化神經移植物并對其生物學性能進行評價，為獲得可橋接周圍神經缺損并可促進周圍神經再生以及功能恢復的生物性神經移植物做一臨床前研究。
　　第一部分Myroilysin脫細胞異種神經支架的制備與結構觀察

2、
　　目的:制備一種新型脫細胞異種神經支架并對其進行結構觀察。
　　方法:獲取新西蘭大白兔坐骨神經后，分別利用經典是Sondell化學法和新型Myroilysin酶對其進行脫細胞處理，大體觀察并制作組織切片經HE染色、Masson染色后光學顯微鏡下觀察脫細胞神經支架的脫細胞效果、所保留神經基底膜結構以及膠原結構，制作電鏡標本通過掃描電鏡觀察不同方法制備的神經支架的表面物理性狀。
　　結果:經Sondell化學法處理的神

3、經直徑基本無變化或稍小于天然神經，但經Myroilysin酶法處理的神經有膨脹現(xiàn)象并且更為透明。組織學觀察，Myroilysin脫細胞神經獲得了與經典Sondell化學法一致的結果，細胞、軸突、髓鞘結構消失，神經基底膜呈波浪狀，膠原纖維排列均勻有序。掃描電鏡結果顯示Myroilysin酶法比化學法獲得的神經支架結構呈現(xiàn)更為明顯的縱形溝壑狀。
　　結論:Myroilysin酶法作為一種新型的脫細胞神經支架制備方法，與sondell具

4、有類似的脫細胞效果，并且利用該方法制備的神經支架同樣保留有均勻一致的基底膜結構。但Myroilysin脫細胞神經支架更為明顯的縱形溝壑狀結構可能對種子細胞的生長有“地形誘導”作用，是值得考慮的一種神經支架材料。
　　第二部分人牙髓前體細胞的培養(yǎng)以及與神經組織細胞相關的蛋白表達
　　目的:培養(yǎng)牙髓前體細胞并初步鑒定，探討其作為組織工程化神經移植物種子細胞的可行性。
　　方法:獲取臨床就診的15-18歲患者中因正畸需要拔除

5、并且牙根尚未完全發(fā)育完成的第三恒磨牙牙髓組織。按照Gronthos酶消化法進行原代培養(yǎng)，獲得牙髓細胞，并進行傳代，對其第三代細胞進行免疫熒光染色，鑒定間充質干細胞標記STRO-1和周圍神經雪旺細胞標記S-100。
　　結果:獲得了能夠高度增殖的細胞，免疫熒光結果顯示所培養(yǎng)的細胞中存在STRO-1陽性的細胞，同時也存在S-100陽性的細胞。
　　結論:本研究所獲得的細胞中存在牙髓前體細胞，并且存在與某些神經細胞功能相似的細胞，

6、將S-100陽性的牙髓前體細胞作為周圍神經組織工程的種子細胞以獲得更具神經營養(yǎng)功能的神經移植物具有一定的可行性。
　　第三部分Myroilysin脫細胞異種神經支架的生物學性能
　　目的:評價Myroilysin脫細胞異種神經支架的生物學性能，探討牙髓前體細胞與該神經支架的生物適合性，為將來構建用于臨床使用的新型人工神經提供理論依據。
　　方法:制備脫細胞神經支架浸提液，與牙髓前體細胞共培養(yǎng)，通過CCK-8細胞增殖試驗

7、評價該支架的細胞相容性;將脫細胞異種神經支架植入Wistar大鼠皮下，術后分別在1周和4周取材，制作組織切片鏡下觀察支架與周圍組織的反應以評價其組織相容性。利用Ⅰ型膠原酶酶解天然神經和Myroilysin脫細胞神經，比較二者的膠原穩(wěn)定性，從而評價其降解情況。將人牙髓前體細胞植入Myroilysin脫細胞神經支架，通過EdU試驗，觀察細胞在支架上生長的排列模式。將牙髓前體細胞與Myroilysin脫細胞神經浸提液共培養(yǎng)，通過實時熒光PCR

8、相對定量分析支架浸提液對牙髓前體細胞表達神經營養(yǎng)因子NGF和BDNF在mRNA水平的影響。
　　結果:牙髓前體細胞與Myroilysin脫細胞神經浸提液共培養(yǎng)4天至6天后，其增殖活性高于其單獨培養(yǎng)，表現(xiàn)出良好的細胞相容性;該支架材料植入大鼠背部皮下后，雖在植入早期出現(xiàn)急性炎癥，但隨即呈現(xiàn)組織修復過程，未出現(xiàn)不良反應，具有良好的組織相容性。Myroilysin脫細胞異種神經支架的降解速率與天然神經基本一致。Myroilysin脫細胞

9、異種神經支架可使牙髓前體細胞粘附其上并呈現(xiàn)較為明顯的方向性生長方式。牙髓前體細胞與Myroilysin脫細胞異種神經支架浸提液共培養(yǎng)后，神經營養(yǎng)因子NGF和BDNF在mRNA水平出現(xiàn)了上調。
　　結論:Myroilysin脫細胞異種神經支架具有良好的生物相容性和體外降解速率，其多孔的縱形溝壑狀結構可發(fā)揮“地形誘導”作用，同時其保留較好的周圍神經細胞外基質成分具有一定的生物學誘導，可使牙髓前體細胞粘附其上并呈現(xiàn)較為明顯的方向性生長，