中國番茄黃化曲葉病毒衛(wèi)星DNA編碼的βC1蛋白的磷酸化對其抑制轉錄水平基因沉默的影響.pdf

1、中國番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)是單組份的雙生病毒，其伴隨的衛(wèi)星DNA(Tomatoyellow leaf curl China Betasatellite，TYLCCNB)編碼的βC1蛋白是一個致病因子和RNA沉默抑制子，不僅能夠誘導嚴重的病毒癥狀而且能夠抑制甲基化介導的轉錄水平基因沉默(Transcriptional gene silencing，TGS)。

2、為了抵御雙生病毒的侵染，番茄中具有激酶活性的SlSnRK1[Snf(sucrose non-fermenting)-1-relatedprotein kinases1]蛋白可以通過磷酸化βC1從而減輕病毒誘導的癥狀。但是，目前尚不清楚βC1的磷酸化如何進一步影響其相關功能。因此，本文圍繞βC1蛋白的磷酸化修飾對其抑制TGS能力的影響開展了相關研究。
　　前期的研究表明，將βC1蛋白兩個潛在的磷酸化位點—第33位的絲氨酸(Serin

3、e，Ser)和78位的蘇氨酸(Threonine，Thr)，分別或者同時突變?yōu)榻M成型磷酸化的天冬氨酸(Aspartic acid,Asp)，突變體的侵染性克隆在本氏煙上的發(fā)病時間延遲，侵染效率下降;而將Ser33和Thr78分別或者同時突變?yōu)椴荒鼙涣姿峄谋彼?Alanine，Ala)后，突變體侵染性克隆在本氏煙上的發(fā)病時間和侵染效率與野生型βC1的侵染性克隆相似。
　　為了明確βC1磷酸化是否影響βC1蛋白的表達水平，首先將構

4、建于馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)表達載體上的6個βC1磷酸化突變體pGR106-βC1S33A、pGR106-βC1S33D、 pGR106-βC1T78A、 pGR106-βC1T78D、 pGR106-βC1S33A/T78A和pGR106-βC1S33D/T78D分別接種本氏煙，以βC1的單克隆抗體進行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)βC1突變后其蛋白表達量無明顯差異。進一步將PVX相關重組載體接種GFP

5、轉錄水平沉默的16-TGS本氏煙，發(fā)現(xiàn)βC1的非組成型磷酸化突變體pGR106-βC1S33A、pGR106-βC1T78A和pGR106-βC1S33A/T78A與野生型pGR106-βC1一樣可以回復GFP熒光，但是其組成型磷酸化的突變體pGR106-βC1S33D、pGR106-βC1T78D和pGR106-βC1S33D/T78D不能回復GFP熒光，表明βC1的組成型磷酸化突變體不能抑制GFP的轉錄水平基因沉默。
　　利用

6、Chop-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，βC1非組成型磷酸化突變體侵染性克隆TYLCCNBS33A、TYLCCNBT78A和TYLCCNBS33A/T78A與野生型TYLCCNB一樣可以降低其輔助病毒TYLCCNV基因組的甲基化水平，但是βC1組成型磷酸化突變體的侵染性克隆TYLCCNBS33D、TYLCCNBT78D和TYLCCNBS33D/T78D不能降低輔助病毒TYLCCNV基因組的甲基化水平，表明βC1的組成型磷酸化突變體減弱了其抑制輔助病毒