19073.半滑舌鰨基因cathepsinb、d和l的鑒定與表達(dá)分析

1、摘要IdentificationandExpressionAn遏sisof：叢耽逝糾眇圈翻暇彩函啊婦一oo。。。。____o■■■___o●■■■_________I______________________一CathepsinBDandLByChenLingADissertationSubmittedtoGraduateUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmento

2、ftherequirementForthedegreeof0nstituteofOceanologyChineseAcademyofSciences，266071)(GraduatedUniversityofChineseAcademyofSciences10049)May2012摘要摘要組織蛋白酶是溶酶體蛋白酶中的一大家族，在蛋白降解、抗原提呈、細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。組織蛋白酶家族可以分為三類，分別為半胱氨酸蛋白酶(包括

3、組織蛋白酶B和L)、絲氨酸蛋白酶及天冬氨酸蛋白酶(包括組織蛋白酶D)。組織蛋白酶B、D和L已在許多其他物種如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)和貝類等發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)行了相關(guān)功能研究，但是，在魚(yú)類中它們的研究卻很少。本研究從半滑舌鰨(Cynoglosxussemilaevis)中克隆了組織蛋白酶B、D和L的同源物，分別命名為CsCatB、CsCatD和CsCatL，并分析了它們?cè)诓煌瑮l件下的表達(dá)變化情況以及酶活特性。CsCatB編碼322個(gè)氨基酸，與其他硬骨魚(yú)及

4、哺乳動(dòng)物中的組織蛋白酶B有708l。3％的全序列同源性。CsCatB具有典型組織蛋白酶的結(jié)構(gòu)特征，包括有前肽區(qū)和半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，后者包含了四個(gè)高度保守的催化位點(diǎn)QlOl，C107，H277，和N297。實(shí)時(shí)定量RTPCR結(jié)果顯示，CsCatB在多個(gè)組織中均有表達(dá)，在細(xì)菌和亞單位疫苗刺激后表達(dá)上調(diào)。重組表達(dá)的CsCatB表現(xiàn)出明顯的蛋白酶活性，其最適溫度為350C，最適PH為55。當(dāng)CsCatB的H277突變?yōu)楣劝彼岷?，其蛋白酶活?/p>

5、顯著下降。CsCatD編碼396個(gè)氨基酸，與其他魚(yú)類及哺乳動(dòng)物中的組織蛋白酶D有676884％的全序列同源性。CsCatD具有天冬氨酸內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域，包含由兩個(gè)天冬氨酸形成的催化位點(diǎn)。CsCatL編碼336個(gè)氨基酸，與其他魚(yú)類以及哺乳動(dòng)物組織蛋白酶L有647902％的同源性。CsCatLN端具有前肽抑制結(jié)構(gòu)域，其下游是半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，含4個(gè)高度保守的催化位點(diǎn)，分別為Gln133，Cys139，His279，和Asn303。重組表達(dá)的

6、CsCatL表現(xiàn)明顯的蛋白酶活性。實(shí)時(shí)定量RTPCR結(jié)果顯示，CsCatD和CsCatL在多個(gè)組織中組成型表達(dá)，其表達(dá)量在心臟中最低，在肝臟中最高。在受到細(xì)菌、病毒以及亞單位疫苗刺激后，CsCatD和CsCatL在頭腎及脾臟中的表達(dá)顯著上調(diào)，并且這種誘導(dǎo)型表達(dá)是時(shí)間依賴性的。上述結(jié)果顯示，CsCatB和CsCatD具有蛋白酶活性，并且可能在機(jī)體對(duì)細(xì)菌及疫苗的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，CsCatD和CsCatL除可能具有上述免疫功能外，還可能參