半滑舌鰨生殖細胞標(biāo)記基因的克隆、表達及調(diào)控區(qū)功能驗證.pdf

1、原始生殖細胞(PGCs)是生殖細胞的祖細胞,在胚胎發(fā)育的早期形成后遷移到性腺原基,成為性原細胞,并最終發(fā)育成兩性配子。近年來,由于對性別分化機制研究的不斷深入,生殖細胞的發(fā)生發(fā)育和分化日益成為科學(xué)研究的熱點。魚類生殖細胞標(biāo)記基因的研究將為深入開展魚類生殖細胞發(fā)生發(fā)育、遷移和性別分化研究奠定堅實基礎(chǔ),同時對魚類種質(zhì)資源保存和繁殖育種都具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。然而目前海水養(yǎng)殖魚類生殖細胞標(biāo)記基因的相關(guān)研究較少。半滑舌鰨(Cynoglo

2、ssus semilaevis)是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類。而半滑舌鰨雌魚比雄魚生長快且個體大,在養(yǎng)殖條件下生理雌魚比例低、不能自然產(chǎn)卵且產(chǎn)卵量有限,限制了舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。全雌苗種的培育和代理繁殖技術(shù)可以解決上述問題,但是對半滑舌鰨性別分化機制缺乏深入了解和生殖細胞標(biāo)記基因的研究非常有限,成為制約相關(guān)研究開展的重要因素。
　　本研究通過RACE和PCR結(jié)合的方法克隆了半滑舌鰨生殖細胞標(biāo)記基因vasa、nanos、dnd和p

3、ou2全長cDNA和DNA序列,分析這些基因的序列特征。通過熒光定量PCR分析這些基因在胚胎發(fā)育過程、成魚各組織以及偽雄魚性腺的表達特征,著重研究這些基因在性腺分化期雌雄性別表達差異,初步探討它們的功能,并利用原位雜交技術(shù)研究vasa、nanos和dnd基因在生殖細胞發(fā)育中的表達情況;同時采用染色體步移和PCR擴增技術(shù)克隆了vasa、nanos、dnd和pou2基因5'和3'調(diào)控序列,并通過在線軟件預(yù)測這些基因啟動子潛在的轉(zhuǎn)錄因子(TF

4、)結(jié)合位點,進而構(gòu)建vasa和nanos基因調(diào)控序列與綠色熒光蛋白(GFP)基因的融合表達載體并在模式魚青鳉上采用轉(zhuǎn)基因和 RNA定位表達技術(shù)驗證了其功能。本研究為半滑舌鰨原始生殖細胞的標(biāo)記和操作(分離、冷凍保存和移植等)奠定了基礎(chǔ),同時為半滑舌鰨的性別分化機制和生殖細胞發(fā)生發(fā)育研究提供了基礎(chǔ)資料。主要研究結(jié)果如下:
　　1.序列分析結(jié)果表明,半滑舌鰨Vasa氨基酸序列(CsVasa)具有DEAD-box家族蛋白8個保守基序;進化

5、分析顯示CsVasa屬于硬骨魚類Vasa蛋白分支并和塞內(nèi)加爾鰨聚在一起。原位雜交結(jié)果表明半滑舌鰨 vasa基因(Csvasa)在生殖細胞中特異表達。定量PCR結(jié)果顯示Csvasa主要在性腺中表達,在偽雄魚性腺的表達量顯著低于正常雌雄魚性腺,在胚胎發(fā)育中表達量總體呈逐漸降低的趨勢,Csvasa基因在性別分化期的表達呈典型的性別二態(tài)性。
　　2.預(yù)測Csvasa基因5'側(cè)翼序列(5.2 kb)的一些典型的TF結(jié)合位點,進而構(gòu)建pCsv

6、asa-GFP-T和GFP-Csvasa3'UTR質(zhì)粒,通過顯微注射技術(shù)發(fā)現(xiàn)Csvasa啟動子具有驅(qū)動 GFP轉(zhuǎn)錄的功能和 Csvasa3′UTR能夠標(biāo)記青鳉發(fā)育過程中的PGCs。
　　3.舌鰨 Nanos序列(CsNanos)分析發(fā)現(xiàn)其序列具有兩個保守的 CCHC鋅指結(jié)構(gòu)域,進化分析表明CsNanos歸為Nanos2分支。原位雜交結(jié)果顯示Csdnd主要在性腺生殖細胞中表達。熒光定量PCR結(jié)果表明Csnanos在性腺中表達量最高,

7、其次是肝臟,其余組織的表達量相對較低,偽雄魚表達量顯著低于正常雌雄魚,胚胎發(fā)育期呈現(xiàn)先升高后降低的表達趨勢,Csnanos在性別分化期呈現(xiàn)性別二態(tài)性表達特征。
　　4.預(yù)測Csnanos基因5'側(cè)翼序列(3.7 kb)TF結(jié)合位點,構(gòu)建了GFP-Csnanos3′UTR載體,體外合成融合GFP和Csnanos3′UTR的雜合mRNA,通過顯微注射技術(shù)發(fā)現(xiàn)Csnanos基因3′UTR能夠標(biāo)記青鳉胚胎發(fā)育過程中的PGCs。
　　

8、5.半滑舌鰨Dnd序列(CsDnd)分析發(fā)現(xiàn)其包含RNA識別基序RRM、CR1~4、NR在內(nèi)的6個保守基序,進化分析顯示CsDnd屬于Dnd家族硬骨魚分支。獲得舌鰨dnd基因(Csdnd)5'側(cè)翼序列2.7 kb和3'側(cè)翼序列1.8 kb,分析了半滑舌鰨Csdnd5'側(cè)翼序列潛在TF結(jié)合位點。原位雜交結(jié)果顯示Csdnd在性腺生殖細胞中特異表達。定量 PCR結(jié)果表明,Csdnd主要在性腺中表達,偽雄魚性腺Csdnd表達量顯著低于正常雌雄魚

9、,Csdnd在胚胎發(fā)育過程中呈降低的趨勢, Csdnd在性別分化過程中呈性別二態(tài)性表達特征。
　　6.舌鰨Pou2序列(CsPou2)分析發(fā)現(xiàn)其包含Pou家族的POUs和POUh兩個保守結(jié)構(gòu)域,進化分析顯示CsPou2歸為Pou家族的Pou2分支。獲得舌鰨pou2基因(Cspou2)5'側(cè)翼序列4.1 kb和3'側(cè)翼序列1.7 kb,在線分析了Csdnd5'側(cè)翼序列潛在TF結(jié)合位點。定量PCR結(jié)果顯示,Cspou2表達主要分布在雌