半滑舌鰨StAR基因的克隆和表達分析及性別相關基因(FTZ-F1、neurl3)原位雜交分析.pdf

1、半滑舌鰨是我國一種重要的海水養(yǎng)殖魚類,由于半滑舌鰨營養(yǎng)價值豐富,具有廣闊的養(yǎng)殖前景。并且在發(fā)育過程中,半滑舌鰨雌雄差異大,在自然條件下容易發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。因此,研究半滑舌鰨性別控制的相關基因決定機制是一個十分重要的研究方向。本文通過對半滑舌鰨StAR基因的克隆,發(fā)現(xiàn)該基因在半滑舌鰨精巢的表達量明顯,推測該基因?qū)驳陌l(fā)育和精細胞的發(fā)生有密切關系,對半滑舌鰨在性別相關基因的挖掘工作做了很好的基礎性工作,為進一步研究性別相關基因提供基礎性材料。

2、
　　利用半滑舌鰨性腺轉(zhuǎn)錄組測序獲得的StAR基因部分序列,設計RACE引物,克隆了半滑舌鰨StAR基因的cDNA序列全長為1294bp,5′端UTR為132bp,3′端UTR為310bp,開放閱讀框(ORF)為852bp,共編碼283個氨基酸。將半滑舌鰨StAR基因與其他物種StAR基因進行氨基酸同源性分析,結(jié)果顯示,半滑舌鰨StAR與塞內(nèi)加爾鰨、大口黑鱸、花鱸、金頭鯛的同源性都達到了85℅,和虹鱒、斜帶石斑魚及日本鰻鱺的同源性

3、分別為81℅、83℅和76℅。StAR基因的雌、雄魚不同組織表達分析表明,StAR基因在雄魚性腺中高表達,在雄魚的肝臟、腦及心臟中表達量較低,而在雄魚的其它組織中不表達;在雌魚腸中不表達,在其它組織(卵巢、肝臟、脾臟、腦、垂體、肌肉、心臟、腎臟)中微量表達。熒光定量PCR分析不同組織與不同時期性腺表達譜表明,雄魚性腺中StAR基因的表達量顯著高于雌、雄魚其它各組織(p<0.05),提示StAR基因?qū)π埕~精巢發(fā)育起重要作用。雄魚不同時期表

4、達譜分析結(jié)果顯示:StAR基因在66天前的精巢中不表達,在150天時表達量急劇增加,至二齡時表達量最高,三齡時表達量下降,說明該基因在精巢發(fā)育成熟過程中起重要作用。原位雜交結(jié)果顯示StAR基因主要在雄魚精巢的精子細胞中表達,而在半滑舌鰨雌魚的卵巢中不表達。通過以上研究表明,StAR基因在半滑舌鰨精巢發(fā)育中發(fā)揮作用,且可能在精子形成中發(fā)揮重要作用,為進一步研究StAR基因在半滑舌鰨生殖調(diào)控中的功能和作用機制奠定了重要基礎。
　　對早

5、期半滑舌鰨不同發(fā)育時期的性腺進行組織學分析。通過觀察可以發(fā)現(xiàn)該批采集的魚苗,26d雌魚、雄魚都沒有發(fā)生分化,性腺中聚集大量的原始生殖細胞。46d雌魚、雄魚雌魚沒有明顯的分化,雌魚性腺中出現(xiàn)卵原細胞,雄魚性腺中有精原細胞。66d雌魚性腺出現(xiàn)多個隆起,卵原細胞增多,66d雄魚精巢中有輸精小管的形成,在此時期已經(jīng)有明顯的分化。86d雌魚可以觀察到明顯的卵巢腔的出現(xiàn),說明卵巢的分化已經(jīng)正式開始,86d雄魚也產(chǎn)生了大量的次級精母細胞,有精小葉結(jié)構

6、形成,有多個裂隙結(jié)構。關于半滑舌鰨早期性腺分化的具體時期還沒有明顯的界定,因為性腺的發(fā)育會受到多種因素的影響,其中溫度對半滑舌鰨性腺發(fā)育的影響明顯。已經(jīng)證明卵巢的腔的形成為卵巢分化形成的重要標志。
　　通過原位雜交技術,分別對FTZ-F1基因和neurl3基因進行了組織學定位。結(jié)果顯示FTZ-F1基因在半滑舌鰨的雌魚和雄魚中都有雜交信號,但在精巢中的雜交信號明顯強烈,隨著精巢的成熟雜交信號明顯加強,44d的雄魚主要在精原細胞中信號

7、最強,205d的精巢中雜交信號主要集中在精子細胞中。卵巢中該基因的雜交信號較弱,44d的雌性原始性腺中原始生殖細胞有較弱的表達,在205d的雌魚卵巢中該基因主要在卵母細胞的膜中表達。neurl3基因原位雜交表達分析結(jié)果顯示,該基因在半滑舌鰨的精巢中表達信號強,2齡的雄魚中檢測到了該基因的雜交信號,雜交信號主要集中在成熟的精子細胞表達,成年的卵巢中沒有該基因的表達。對于三倍體的半滑舌鰨雄魚也檢測到了該基因的表達,但表達程度明顯比正常的雄魚