29607.半滑舌鰨(cynoglossussemilaevis)tlr9及其信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的克隆與表達(dá)

1、中國(guó)海洋大學(xué)博士學(xué)位論文半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）TLR9及其信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的克隆與表達(dá)姓名：于燕申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：張全啟20090601列由23bp5’UTR，342bp3’UTR以及3186bpORF組成，其ORF編碼1062個(gè)aa，包含胞外區(qū)14個(gè)富含亮氨酸的基序(LRRmotif)，跨膜區(qū)(TM)和胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域(TIRdomain)。csTLR9與金頭鯛和牙鲆TLR9同源性

2、高于60％。RealtimePCR結(jié)果顯示esTLR9廣泛表達(dá)于各個(gè)組織中，尤其是脾臟和性腺中表達(dá)量很高。免疫刺激試驗(yàn)表明，注射滅活鰻弧菌后，半滑舌鰨脾臟和頭腎中TLR9的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化。發(fā)育階段TLR9表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)母源性TLR9mRNA的存在，且在變態(tài)時(shí)期TLR9表達(dá)量顯著降低，暗示TLR9可能參與半滑舌鰨個(gè)體發(fā)育，在其發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。雖然存在物種間差異，但csTLR9無(wú)論是在序列上，還是在表達(dá)方面都表現(xiàn)出與其他魚類及

3、哺乳動(dòng)物的相似性。2半滑舌鰨MyD88基因的克隆及表達(dá)分析MyD88是IL1R／TLR超家族胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)中重要的接頭蛋白。半滑舌鰨MyD88基因全長(zhǎng)2855bp，包含5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子；其eDNA包含110bp5’UTR，576bP3UTR和編碼285aa的編碼區(qū)。csMyD88與其他魚類及哺乳類MyD88序列相似性很高，與牙鲆MyD88相似性高于70％。csMyD88包含一個(gè)TIR結(jié)構(gòu)域，一個(gè)致死域(DD)及連接二者的中間區(qū)域(I

4、D)。RT—PCR結(jié)果表明csMyD88在不同組織中的表達(dá)情況與TLR9類似，在所檢測(cè)的12種組織中csMyD88都有表達(dá)，尤其在脾臟和性腺中表達(dá)水平很高。腹腔注射滅活鰻弧菌后，半滑舌鰨脾臟和頭腎中MyD88的表達(dá)水平顯著升高。在半滑舌鰨的發(fā)育過(guò)程中，csMyD88的表達(dá)量表現(xiàn)出隨發(fā)育時(shí)期而變化的特征。esMyD88與其他脊椎動(dòng)物在序列上及表達(dá)特征上的相似性，暗示脊椎動(dòng)物MyD88在功能及作用機(jī)制上的保守性。3半滑舌鰨lRAK4基因的克

5、隆及表達(dá)分析IRAK4在TLR／IL1R超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要的地位。IRAK4通過(guò)磷酸化IRAKI的KD區(qū)，激活I(lǐng)RAKl，將信號(hào)向下傳導(dǎo)。通過(guò)拼接核心片段、3’及5’末端得到cslRAK4cDNA全序列，包括5’UTR168bp，3UTR580bp以及ORF1401bp。SMART分析表明cslRAK4包含一個(gè)典型STKc結(jié)構(gòu)域(serine／threoninekinasescatalyticdomain)和一個(gè)致死域。cslRA