煙草ABF轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及功能分析.pdf

1、干旱、低溫和高鹽等是影響植物生長的主要非生物脅迫因素,也是導(dǎo)致作物減產(chǎn)的直接原因,嚴重的情況下,甚至引起植物死亡。煙草是轉(zhuǎn)基因重要模式生物,也是我國主要的經(jīng)濟作物,對功能基因組研究和經(jīng)濟發(fā)展均具有重要意義。在煙草整個生育期,對水分的要求很高,只有在充足的水份供應(yīng)下,才能確保煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量。然而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,由于地理因素的限制和周期性氣候變化,我國煙草農(nóng)業(yè)遭遇了巨大的損失。分離鑒定煙草受非生物脅迫誘導(dǎo)的基因,對揭示煙草抗逆分子機制和煙草

2、抗逆遺傳改良均具有重要的意義。
　　ABI5/AREB/ABF轉(zhuǎn)錄因子屬于bZip轉(zhuǎn)錄因子的A亞族,特異存在于植物中,處于 ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵位置,功能涉及干旱和激素等逆境信號的傳遞。ABI5/AREB/ABF轉(zhuǎn)錄因子通過與脅迫響應(yīng)基因啟動子區(qū)ABRE元件相結(jié)合,調(diào)控脅迫響應(yīng)基因表達,提高植物的抗旱性,因此,在非生物脅迫信號傳遞的過程中, ABI5/AREB/ABF轉(zhuǎn)錄因子充當了一個傳遞開關(guān)的作用,在植物抗逆境脅迫過程中具有

3、重要作用。為揭示煙草抗非生物脅迫分子機制,培育優(yōu)質(zhì)的基因品種,本研究從栽培煙草“紅花大金元”中克隆到2個煙草ABF類基因,NtABF1和NtABF2,并分別從其表達特性、啟動子識別特異性、轉(zhuǎn)基因植株抗非生物脅迫能力等方面對基因功能進行綜合的評價,為揭示其在植物抗逆境脅迫中的功能和作用機理提供更多參考。主要實驗結(jié)果如下:
　?、贌煵軳tABF1和NtABF2基因的克隆及生物信息學分析
　　從煙草品種“紅花大金元”中成功克隆到2

4、個ABF基因,NtABF1(GenBank登陸號KF736849)和NtABF2(Genbank登錄號KF736850),對NtABF1和NtABF2生物信息學結(jié)果表明,NtABF1基因開放閱讀框(ORF)長999bp,編碼332個氨基酸,蛋白分子量36.45 kDa,等電點9.04;NtABF2基因ORF長1305bp,編碼433個氨基酸,蛋白分子量46.92 kDa,等電點9.35。NtABF1和NtABF2均為含有BRLZ保守結(jié)構(gòu)

5、域的親水蛋白,不含信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)。其高級結(jié)構(gòu)均以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主,β轉(zhuǎn)角和延伸鏈含量較少。在亞細胞水平上,NtABF1和NtABF2均定位于細胞核。磷酸化位點分析表明,兩蛋白均含有Ser,Thr和Tyr等激酶識別位點。進化分析和多序列比對結(jié)果表明,NtABF1與AtAREB3的進化關(guān)系最近,序列相似性達54.49％;NtABF2與SlAREB1,StABF1,StABF的親緣關(guān)系較近,序列相似性分別為83.63％,83.52％和

6、83％。功能預(yù)測結(jié)果顯示,NtABF1和NtABF2均為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。
　?、跓煵軳tABF1和NtABF2基因表達模式分析
　　NtABF1和NtABF2基因組織表達模式分析結(jié)果表明,NtABF1和NtABF2表達模式基本一致,在根中相對表達量最高,其次是莖、葉、花,在各組織中,NtABF1相對表達量均高于 NtABF2。NtABF1和 NtABF2基因逆境表達譜分析結(jié)果表明, NtABF2基因表達更易受到各逆境因素的影響

7、:PEG、干旱、NaCl、低溫、ABA誘導(dǎo)NtABF2上調(diào)表達,MeJA誘導(dǎo)NtABF2下調(diào)表達;NtABF1基因受PEG、NaCl、低溫、ABA誘導(dǎo),而干旱、MeJA抑制NtABF1基因的表達。
　?、蹮煵軳tABF1和NtABF2蛋白與ABRE元件體外結(jié)合能力分析
　　成功構(gòu)建了煙草 NtABF1和 NtABF2基因原核表達載體,pET28a-NtABF1和pET28a-NtABF2,轉(zhuǎn)化表達菌TransRosetta(

8、DE3),誘導(dǎo)目的蛋白表達,純化目的蛋白,并通過EMSA實驗體外檢測目的蛋白分別與C-box及G-box ABRE元件結(jié)合能力,電泳結(jié)果表明,NtABF1和NtABF2蛋白均能特異識別并結(jié)合C-box ABRE元件,NtABF2與C-box ABRE元件結(jié)合信號較強,當適當提高NtABF2蛋白濃度后,能夠檢測到NtABF2與G-box元件特異結(jié)合信號。
　?、軣煵軳tABF1和NtABF2過表達轉(zhuǎn)基因株系的獲得及功能鑒定
　

9、　成功構(gòu)建了煙草NtABF1和NtABF2基因植物過表達載體pCXSN:35S:NtABF1和pCXSN:35S:NtABF2,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404,葉盤法轉(zhuǎn)化煙草,PCR篩選獲得NtABF1和 NtABF2陽性轉(zhuǎn)基因株系各19株。控水處理30天后,對pCXSN:35S:NtABF1基因轉(zhuǎn)基因株系7＃、8＃、10＃及pCXSN:35S:NtABF2基因轉(zhuǎn)基因株系11＃、14＃、17＃目的基因(NtABF1或NtABF2)及逆境誘導(dǎo)基

10、因定量分析結(jié)果顯示,pCXSN:35S:NtABF1過表達轉(zhuǎn)基因株系7＃、8＃、10＃中NtABF1基因表達量顯著高于對照,且株系7＃和8＃中,NtAPX及NtERD10C表達量升高,而在這三個株系中,NtNCED1基因的表達均受到抑制,推測這三個株系可能通過其他的逆境響應(yīng)途徑如ROS清除,誘導(dǎo)抗逆蛋白的表達等途徑增強轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性;pCXSN:35S:NtABF2過表達轉(zhuǎn)基因株系17＃葉片中NtABF2、NtAPX和NtNCED1