胸膜肺炎放線桿菌五基因缺失疫苗菌株構(gòu)建及生物學(xué)特性分析.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一種豬的接觸傳染性呼吸道疾病，主要引起肺的纖維性滲出、壞死性肺炎及肺膜的增厚炎性滲出，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 目前疫苗接種仍然是預(yù)防控制該病的主要措施，因而獲取一種針對胸膜肺炎放線桿菌安全、高效、具備良好的交叉保護(hù)力

2、的疫苗擁有極大的前景。弱毒活疫苗免疫動(dòng)物后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫力，可獲得一定的對異型血清型菌的交叉保護(hù)力。主要研究內(nèi)容如下。
　　 1、五基因缺失疫苗菌株構(gòu)建及生物學(xué)特性的研究本研究通過接合轉(zhuǎn)移和同源重組等方法在四基因缺失疫苗菌株CH04（△apxⅠC/△apxⅡC/△apxⅣ-orf1/△cpxAR）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步敲除了arcA雙組份基因，成功構(gòu)建五基因缺失疫苗菌株YWJ05(△apxⅠC/△apxⅡC/△apxⅣ-orf1/

3、△cpxAR/△arcA)，生長速率結(jié)果表明:較之CH04和APP血清1型野毒（WT，下同）菌株，YWJ05菌株的生長速率下降不顯著。在體外采用PK-15細(xì)胞進(jìn)行粘附和侵入試驗(yàn)，在肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)檢測細(xì)菌的抗吞噬能力，運(yùn)用中心粒細(xì)胞介導(dǎo)殺傷試驗(yàn)(PMN)來了解兩個(gè)突變株的抗殺傷能力的不同，細(xì)胞試驗(yàn)的結(jié)果表明:YWJ05菌株的抗殺傷能力低于CH04菌株。
　　 2、五基因缺失疫苗菌株對小鼠毒力分析為了比較關(guān)于兩個(gè)突變株對小鼠毒力差異

4、，每個(gè)菌使用四個(gè)濃度，每個(gè)稀釋度腹腔接種6只Balb/C小鼠，每只200μL，然后通過統(tǒng)計(jì)各突變株感染小鼠后10天后的存活數(shù)量，計(jì)算LD50。LD50結(jié)果表明YWJ05菌株的毒力相對于CH04菌株，差異不顯著，但較之野毒，下降則極為顯著。
　　 3、五基因缺失疫苗菌株對小鼠免疫保護(hù)力研究為了解淋巴細(xì)胞的增殖情況，我們提取二免后七天小鼠的脾臟來進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YWJ05疫苗菌株免疫組OD490比值明顯低于CH04疫苗

5、菌株免疫組，取二免7天后小鼠血清和WT孵育，再與空白小鼠全血作用，發(fā)現(xiàn)YWJ05組殺傷率明顯高于CH04組，說明YWJ05菌株誘導(dǎo)抗體的表達(dá)有相當(dāng)程度地提高。通過ELISA檢測免疫后14、28天小鼠血清中的ApxⅣA抗體，結(jié)果YWJ05組的抗體滴度高于CH04，這與全血?dú)⒕慕Y(jié)果吻合。
　　 對二免后7天小鼠血清進(jìn)行抗體分型檢測，結(jié)果兩個(gè)疫苗菌株都呈現(xiàn)IgG1抗體水平明顯高于IgG2a，這表明突變株在體內(nèi)主要引起Th2型為主的免

6、疫反應(yīng)。再通過檢測淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變株組的IL-6、TNF-α水平都有明顯提高，而且突變株組的IL-6的表達(dá)上升比值都高于TNF-α的表達(dá)上升比值，說明兩個(gè)突變株在小鼠體內(nèi)激發(fā)體液免疫反應(yīng)，這與抗體分型的結(jié)果一致。
　　 在二免后14天，以APP血清1型野毒株3×107CFU(30LD50)攻毒，觀察14天，記錄下每組的死亡情況，發(fā)現(xiàn)CH04、YWJ05組的免疫保護(hù)率都高達(dá)100％，說明在敲除了arcA基