胸膜肺炎放線桿菌ΔapxⅠC-ΔapxⅡC雙基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性和免疫原性的研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(APP)引起的豬的一種高度接觸傳染性呼吸道疾病，給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 預(yù)防和控制該病的主要措施是利用本地主要流行的血清型進(jìn)行免疫接種。目前商品化的全菌滅活疫苗和亞單位疫苗能夠減輕同源血清型菌引起的臨床癥狀并降低死亡率，但不能降低發(fā)病率、慢性感染和阻止肺部病變，對(duì)異源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保護(hù)?？梢哉f(shuō)，采用滅活苗和亞單位疫苗免疫不是最好的選擇，迫切需要

2、更安全、高效的新型疫苗來(lái)預(yù)防和控制該傳染病的發(fā)生與流行。與滅活疫苗和亞單位疫苗不同，APP的自然感染或試驗(yàn)感染能夠誘導(dǎo)抗任何異源血清型的保護(hù)。而且弱毒活疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有能夠重復(fù)提呈抗原和持續(xù)性刺激免疫應(yīng)答的優(yōu)點(diǎn)。因此通過(guò)缺失毒力因子構(gòu)建弱毒活疫苗已成為國(guó)內(nèi)外疫苗研究的熱點(diǎn)。構(gòu)建APP突變株的傳統(tǒng)方法存在很多缺陷。利用化學(xué)或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的突變方法存在隨機(jī)性，遺傳背景不明晰；而通過(guò)傳統(tǒng)的同源重組方法導(dǎo)致靶基因突變而獲得的突變株最后含有抗性

3、標(biāo)記，由于不符合生物安全性要求不能作為疫苗株用于疫苗生產(chǎn)。 鑒于上述背景，本研究旨在以本地分離APP-1型菌株SLW01為親本菌，缺失ApxI和ApxII的激活因子apxIC和apxIIC，構(gòu)建不含抗性標(biāo)記的APP雙基因缺失株，從而發(fā)展一個(gè)能提供有效的交叉保護(hù)效率的無(wú)外源基因的安全、廉價(jià)的APP弱毒活疫苗菌株來(lái)預(yù)防和控制豬傳染性胸膜肺炎的發(fā)生與流行，主要的研究?jī)?nèi)容包括： 1．基因的克隆與重組自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建 參照

4、GenBank中apxI apxlI基因的序列，從SLW01中擴(kuò)增了apxlC和apxlIC基因的上下游片段。將得到的上下游片段，連接到攜帶蔗糖敏感基因(SacB)的自殺性質(zhì)粒pEMOC2上，構(gòu)建缺失了385 bp的apxlC基因的重組自殺性質(zhì)粒pEMAIC和缺失了340 bp的apxIIC基因的重組自殺性質(zhì)粒pEMAIIC。 2．接合轉(zhuǎn)移與缺失株SLW02、SLW03的篩選鑒定 以轉(zhuǎn)化了重組自殺性質(zhì)粒pEMAIC的大腸

5、桿菌β2155為供體菌，APP-1型菌株SLW01為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并轉(zhuǎn)印到含10％蔗糖的平皿上，篩選Cm抗性(Cm<'R>)蔗糖敏感(Sur<'s>)的接合子，進(jìn)一步用PCR鑒定重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)整合到染色體中。鑒定正確的接合子在不含NaC1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)促使第二次同源重組的發(fā)生。涂布含10％蔗糖的平皿，并轉(zhuǎn)印到Cm平皿上，篩選出Cm敏感(Cm<'s>)蔗糖抗性(Sur<'R>)的克隆，用進(jìn)行PCR鑒定，

6、以確定發(fā)生了第二次交換，重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)丟失。從而構(gòu)建單基因缺失株SLW02。在單基因缺失株SLW02(AapxIC)的基礎(chǔ)上，用轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pEMAIIC的大腸桿菌β2155作為供體菌，單基因缺失株SLW02(AapxIC)作為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，用同樣的方法構(gòu)建雙基因缺失株SLW03(△apxlC/△apxIIC)。 3．缺失株生物學(xué)特性的研究 在綿羊血平皿上測(cè)定SLW01、SLW02和SLW03的溶血活性，結(jié)果顯示

7、SLW01具有極強(qiáng)的溶血活性，單基因缺失株SLW02(△apxIC)具有較弱的溶血活性，而雙基因缺失株SLW03(△apxIC/AapxlIC)則失去了溶血活性。 用Western blot檢測(cè)雙缺失株SLW03和親本菌SLW01中毒素的分泌情況，結(jié)果表明SLW01和SLW03都能夠分泌毒素Ⅰ和毒素Ⅱ，說(shuō)明apxIC和apxIIC基因缺失后，SLW03仍然可以分泌無(wú)毒力的毒素。 將缺失株和親本株都進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲

8、線，結(jié)果表明，缺失株SLW02和SLW03與親本菌比較，生長(zhǎng)速度沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明apxIC和apxIIC的缺失對(duì)SLW01的生長(zhǎng)無(wú)影響。 測(cè)定親本菌和缺失菌在Balb/C小鼠體內(nèi)的毒力，計(jì)算LD<,50>的值。結(jié)果顯示，與親本菌SLW01比較，單基因缺失株SLW02(△apxIC)的毒力降低了約200倍，雙基因缺失株SLW03(△apxIC/△apxIIC)的毒力降低了約2000倍。 4．雙基因缺失株SLW03(△a

9、pxlC/△apxIIC)對(duì)小鼠的免疫試驗(yàn)及攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將SLW03和1、2、7型三價(jià)滅活疫苗分別免疫Balb/C雌鼠，免疫2次，間隔2周。于免疫前、一免后2周和二免后2周分別檢測(cè)了APP-1 IHA抗體和毒素ELISA抗體水平。結(jié)果表明，未免疫組的小鼠在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程血清抗體均呈陰性。結(jié)果顯示，SLW03免疫小鼠后不但能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的菌體抗體，而且能夠產(chǎn)生較高的毒素抗體。滅活苗免疫組只能產(chǎn)生IHA抗體，不能產(chǎn)生毒素抗體。

10、二免兩周后，分別用低劑量(10 LD<,50>)和高劑量(100 LD<,50>)的同源血清型1型(SLW01)和異源血清型7型(XFNZ)攻毒。對(duì)于低劑量的攻毒，SLW03免疫組和滅活疫苗免疫組的小鼠都得到了100％的保護(hù)。對(duì)于高劑量的攻毒，SLW03對(duì)1型的保護(hù)率是100％，7型是75％。而滅活疫苗免疫組對(duì)1型和7型的高劑量的攻毒的保護(hù)率分別為25％和37．5％。所以弱毒菌株SLW03在小鼠中的免疫效力優(yōu)于傳統(tǒng)滅活疫苗。 5

11、．SLW03(△apxIC/△apxIIC)對(duì)斷奶仔豬的免疫試驗(yàn)及攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將SLW03分別通過(guò)肌肉免疫和鼻內(nèi)免疫兩種途徑免疫斷奶仔豬，免疫2次，間隔2周。于免疫前、一免后2周和二免后2周分別檢測(cè)了APP-1：IHA抗體和毒素ELISA抗體水平。結(jié)果表明，兩個(gè)免疫組的IHA抗體和ELISA抗體都顯著高于對(duì)照組。但第28天，鼻內(nèi)免疫組的ELISA抗體水平顯著高于肌肉免疫組。二免兩周后分別用同源血清型(1型)和異源血清型(9型)