斑馬魚HIF-1α啟動(dòng)子活性分析及LPS和低氧對(duì)HIF-1α的誘導(dǎo)表達(dá).pdf

1、低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是在低氧環(huán)境下廣泛表達(dá)的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)新陳代謝、發(fā)育、細(xì)胞存活、增殖和病理狀況下都發(fā)揮著重要作用。目前對(duì)于HIF-1α的研究多集中于哺乳動(dòng)物的心腦血管疾病、腫瘤、胚胎發(fā)育等生理病理方面，而魚類與哺乳動(dòng)物相比更容易受到低氧脅迫和污染的侵害，但是關(guān)于魚類HIF-1α的調(diào)節(jié)機(jī)制卻知之甚少。在本研究中，以模式生物斑馬魚（Danio rerio）為研

2、究對(duì)象，對(duì)斑馬魚HIF-1α啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建一系列啟動(dòng)子缺失體的真核表達(dá)載體分析啟動(dòng)子活性，并研究LPS（lipopolysaccharide）和低氧對(duì)HIF-1α基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，探究魚類低氧、炎癥適應(yīng)的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　 1、斑馬魚HIF-1α基因啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析
　　 通過生物學(xué)信息學(xué)軟件對(duì)斑馬魚HIF-1α啟動(dòng)子進(jìn)行分析，genomatix的gene2promoter程序預(yù)測(cè)在-65

3、1 bp至+102 bp處是啟動(dòng)子區(qū)域，結(jié)合這個(gè)結(jié)果我們通過設(shè)計(jì)引物，選擇-1578至+97的1675 bp啟動(dòng)子序列進(jìn)行下一步研究。CpG Island Searcher預(yù)測(cè)CpG島位于-97 bp至+403 bp處，MethPrime預(yù)測(cè)CpG島位于-173 bp至+38 bp處，顯示斑馬魚HIF-1α含有CpG島。對(duì)所選1675 bp啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其包括保守的調(diào)節(jié)元件CEBP(essential regulation

4、 elements CCAAT/enhancerbinding protein)、STAT(signal transducer and activator of transcription)和E-box(enhancer box)，以及應(yīng)激炎癥應(yīng)答元件CREB(cAMP-responsive element bindingproteins)、HSF(heat shock factors)和NF-κB(nuclear factor kap

5、pa B)等。通過對(duì)鯉科魚類近端240 bp序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)其相似性高于82％。將轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)它們共同享有CAAT(CCAAT binding factors)、STAT、HIFF(hypoxia induciblefactor)等轉(zhuǎn)錄因子。
　　 2、斑馬魚HIF-1α基因啟動(dòng)子缺失突變體的構(gòu)建與活性分析
　　 設(shè)計(jì)引物通過PCR擴(kuò)增斑馬魚HIF-1α系列啟動(dòng)子片段，常規(guī)分子生物學(xué)方法構(gòu)建啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體

6、并進(jìn)行啟動(dòng)子活性分析測(cè)定。結(jié)果成功構(gòu)建6個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子真核表達(dá)載體。雙熒光素酶測(cè)定結(jié)果顯示最高的啟動(dòng)子熒光活性存在于pGL1-1中;但當(dāng)轉(zhuǎn)染pGL1-2和pGL1-3后熒光活性卻幾乎消失，說明-127到+97之間的序列很關(guān)鍵;當(dāng)轉(zhuǎn)染pGL2-1，pGL2-2和pGL2-3這些包含-127到+97序列的質(zhì)粒后顯示出很好的啟動(dòng)活性;說明我們所構(gòu)建的最小啟動(dòng)子缺失體pGL2-3(-134至+97)包含最小核心啟動(dòng)子區(qū)。對(duì)-134至+97序

7、列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)此區(qū)間中存在很多順勢(shì)作用元件，例如E-box，CEBP，STAT，HSF，CREB等;在-1578到-930之間可能存在負(fù)性調(diào)控元件IRF(Interferon regulatory factor)和PRDI(positive regulatorydomain I binding factor)。
　　 3、LPS及低氧對(duì)斑馬魚HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)
　　 常氧下用1μg/mL的LPS處理轉(zhuǎn)染后的

8、細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，只有pGL2-2和pGL2-3兩個(gè)缺失體的活性有顯著上升，其他缺失體的活性則沒有明顯變化，說明LPS在常氧下對(duì)HIF-1α的啟動(dòng)子活性并沒有顯著影響。常氧下用不同濃度的LPS處理斑馬魚幼魚(3 dpf)6h后發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的mRNA水平在任何一個(gè)濃度范圍內(nèi)都沒有顯著變化。結(jié)果表明常氧下，在體內(nèi)研究中LPS對(duì)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平也沒有顯著影響。低氧下用不同濃度的LPS處理3dpf斑馬魚幼魚后發(fā)現(xiàn)，僅在低氧條件下HIF-1

9、α的mRNA水平仍然沒有顯著變化。而在加入了各濃度的LPS后發(fā)現(xiàn)HIF-1α mRNA表達(dá)量隨著LPS的濃度開始不斷上升，10μg/mL的LPS顯著激活了HIF-1α的mRNA水平。在時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)中，低氧下用10μg/mL LPS處理斑馬魚幼魚不同時(shí)間后，HIF-1αmRNA表達(dá)量在處理后3h開始緩慢上升，在第8h時(shí)上升到一個(gè)高峰。推測(cè)LPS和低氧在調(diào)節(jié)斑馬魚HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性上存在一種協(xié)同機(jī)制。這種協(xié)同機(jī)制與魚類的生存環(huán)境密切相關(guān)，