葡萄VvUGT72B1基因和楊樹PtUGT72B1基因的合成與功能鑒定.pdf

1、一些酚類化合物(PhenolicCompounds，PCs)及3，4-二氯苯胺(Dichloroaniline，DCA)對生物體具有致癌性、致畸性和致突變性。這些物質(zhì)中許多是農(nóng)藥、防腐劑、消毒劑和偶氮染料等合成和代謝的中間體。由于這些物質(zhì)的廣泛使用，對水資源和土壤造成了污染。它們通過土壤和水體等進入生物鏈，并最終危害著人類的健康。
　　糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyltransferases，GTs，EC2.4.x.y)是一類催化糖基

2、化反應(yīng)的酶，能夠?qū)⑻腔鶑墓w分子轉(zhuǎn)移到特定的受體分子上，從而形成糖苷物。尿苷二磷酸-糖基轉(zhuǎn)移酶(UridineDiphosphate-glycosyltransferases，UGTs)是GTs1家族的成員。在植物體內(nèi)這類酶催化糖基化反應(yīng)時，以UDP-糖為糖基供體將糖基轉(zhuǎn)移到植物激素、次生代謝物、病原菌侵染物以及異源毒素等一系列小分子化合物受體上，從而改變其生物活性、水溶性和穩(wěn)定性等特性。一些PCs及3，4-DCA因其苯環(huán)上帶有羥基或氨

3、基，能夠被植物體內(nèi)許多種糖基轉(zhuǎn)移酶糖基化形成糖苷物而毒性降低。
　　葡萄(Vitisspp.)是世界第二大果樹，自古以來深受人們的喜愛。一些農(nóng)藥的使用和污染水源的灌溉等使得一些有害的PCs和3，4-DCA進入葡萄植株。而這些物質(zhì)在進入葡萄植株后，如何被轉(zhuǎn)化以及是否會通過果實進入人體都鮮為人知。楊樹(Populusspp.)因其生長快、成熟后個體大、對有毒物質(zhì)抗性強、能降解許多污染物，同時也能帶來一定的經(jīng)濟效應(yīng)，是上佳的研究植物修復(fù)

4、的木本植物。
　　葡萄和楊樹的全基因組測序已經(jīng)完成，這為基因功能的研究帶來了便利。本文根據(jù)擬南芥中對2，4，5-三-氯苯酚(Trichlorophenol，TCP)和3，4-DCA糖基化能力最強的AtUGT72B1氨基酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索得到葡萄和楊樹中與之同源性最高的蛋白各一個(GenBankAccessionNo:XP_002280923，XP_002320190)。將這兩個蛋白對應(yīng)的基因分別命名為VvUGT72B1

5、基因和PtUGT72B1基因。通過修飾，并按照PTDS方法合成這兩個基因。將這兩個基因分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母中高量表達，通過篩選和鑒定得到了能夠分別高量表達這兩種蛋白的陽性菌株。將獲得的畢赤酵母陽性菌株進行擴大培養(yǎng)，提取酵母中的蛋白從而獲得重組酶。通過試驗驗證了VvUGT72B1能夠?qū)?，4，5-TCP、2，6-二甲基苯酚(Dimethylphenol，DMP)、苯酚、對苯二酚、鄰苯二酚、3-甲基鄰苯二酚(Methylcatechol，MC)

6、和3，4-DCA糖基化，并提高了酵母對其抗性;PtUGT72B1能夠?qū)⒈椒?、鄰苯二酚和對苯二酚糖基化，并提高了酵母對其抗性?，4，5-TCP、苯酚、對苯二酚和鄰苯二酚被糖基化后的產(chǎn)物分別是2，4，5-TCP-O-葡萄糖苷、苯基葡萄糖苷(Pheny1β-D-glucopyranoside，PGPS)、熊果苷和鄰羥基苯基葡萄糖苷。同時還檢測了這兩種酶對各自底物的活性。通過測定米氏常數(shù)表明PtUGT72B1對鄰苯二酚、苯酚和對苯二酚的親和力

7、依次遞減。
　　將VvUGT72B1基因和PtUGT72B1基因分別轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥進行研究，以便能在將來把這兩個基因能真正應(yīng)用到植物修復(fù)當中。通過農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)過篩選和檢測獲得能夠分別表達這兩個基因的陽性株系。除了苯酚以外，表達葡萄VvUGT72B1的擬南芥對其余五種所測酚類化合物和3，4-DCA的抗性比野生型擬南芥高。表達楊樹PtUGT72B1的擬南芥株系對鄰苯二酚和對苯二酚的抗性比野生型擬南芥提高。而表達VvU

8、GT72B1和PtUGT72B1的擬南芥株系對苯酚的抗性比野生型擬南芥明顯降低。降解試驗結(jié)果表明，兩種轉(zhuǎn)基因擬南芥對各自所測底物的降解能力比野生型擬南芥明顯提高，體內(nèi)生成的糖苷物含量也比野生型擬南芥高。同時，檢測到從表達VvUGT72B1或PtUGT72B1擬南芥中提取的粗酶對各自所測底物的糖基化能力比野生型擬南芥都要高。表明2，4，5-TCP、2，6-DMP、對苯二酚、鄰苯二酚、3-MC和3，4-DCA在擬南芥體內(nèi)被糖基化后對擬南芥的

9、毒性降低，而苯酚在擬南芥體內(nèi)被糖基化后形成的PGPS對擬南芥的毒性增高。然而，由于擬南芥對PGPS的吸收能力遠不及苯酚，使得野生型擬南芥在含PGPS的培養(yǎng)基上的長勢比在含有相同摩爾濃度的苯酚的培養(yǎng)基上的長勢好。此外，擬南芥對熊果苷的吸收能力也遠不及對苯二酚，使得野生型擬南芥在含熊果苷的培養(yǎng)基上的長勢比在含有相同摩爾濃度的對苯二酚的培養(yǎng)基上的長勢好。
　　在本研究中，新發(fā)現(xiàn)了擬南芥能夠?qū)Ⅲw內(nèi)生成的苯酚、2，6-DMP和3-MC的糖苷