葡萄果實(shí)中ACPK1蛋白激酶的基因克隆和功能的初步鑒定.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以巨峰葡萄(Vitisvinifera×VitislabruscaL.cvKyoho)果實(shí)為材料，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室鑒定的脫落酸(abscisicacid,ABA)激活的鈣依賴(lài)蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinase，CDPK)ACPK1(ABA-stimulatedcalcium-dependentproteinkinasel,ACPK1)的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)并引物，利用RT-PCR(reversetra

2、nscription-polymerasechainreaction)和RACE(rapidlyamplificationofcDNAends)技術(shù)克隆得到編碼此蛋白的cDNA全長(zhǎng)序列。cDNA全長(zhǎng)為1714bp，在GenBank的注冊(cè)號(hào)為AY394009。此核苷酸序列具有完整的開(kāi)放閱讀框，編碼區(qū)長(zhǎng)1491bp。經(jīng)相關(guān)軟件分析，ACPK1基因編碼一個(gè)由496個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量為56kDa，其氨基酸序列與馬鈴薯(Solanumtu

3、berosum)，蠶豆(Viciafaba)，大豆和大豆種子(Glycinemax,Glycinemaxseed)，擬南芥(Arabidopsisthaliana)CPK12，水稻(Oryzasativa)，玉米(Zeamays)中的CDPKs分別有83％，81％，81％，77％，76％，76％的同源性。ACPK1具有N端可變域，激酶域，連接域和EF手形鈣結(jié)合域的典型CDPKs的結(jié)構(gòu)特征。ACPK1的氨基酸序列中包含5個(gè)豆蔻酰化位點(diǎn)，在

4、213～231位氨基酸處有一跨膜結(jié)構(gòu)。以α-32P標(biāo)記ACPK1基因的cDNA全長(zhǎng)為探針檢測(cè)顯示，ACPK1在葡萄基因組中可能有兩個(gè)拷貝。 分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T/ACPK1L(cDNA全長(zhǎng)載體)和pGEX-4T/ACPK1-N10(編碼N端40個(gè)氨基酸的cDNA片段載體)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-o-galactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)

5、后產(chǎn)生了83kDa的ACPK1L融合蛋白和31kDa的ACPK1-N40融合蛋白。ACPK1L融合蛋白表現(xiàn)出依賴(lài)Ca2+的膠內(nèi)自磷酸化活性、電泳遷移率的變化以及組氨酸底物磷酸化活性，W7[N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide]抑制ACPK1L的自磷酸化活性和底物磷酸化活性，CaM和W5[N-(6-aminohexyl)-1-naphthalenesulfonamide]對(duì)A

6、CPK1L的自磷酸化活性和底物磷酸化活性沒(méi)有抑制作用。表明ACPK1基因編碼的產(chǎn)物是一個(gè)有活性的CDPK。兩種融合蛋白經(jīng)純化后制備抗體血清，根據(jù)酶聯(lián)免疫分析(linkedimmunosorbentassay,ELISA)、抗原滴度檢測(cè)(Proteindotblot)和Western-blot檢測(cè)，表明制得的抗體血清對(duì)ACPK1具良好的特異性和較高的檢測(cè)靈敏度。 經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ACPK1在葡萄果肉和種子中特異表達(dá)，并呈現(xiàn)不同發(fā)育時(shí)期的

7、表達(dá)差異。不同時(shí)期的表達(dá)差異與內(nèi)源ABA濃度呈正相關(guān)。應(yīng)用外源ABA溫育葡萄果實(shí)圓片的實(shí)驗(yàn)體系證實(shí)，ABA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平激活A(yù)CPK1，且激活效應(yīng)具溫育時(shí)間和ABA劑量的依賴(lài)性。 ACPK1基因在擬南芥中高效表達(dá)植株(ACPK1ox)較同期野生型植株高大，其種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)對(duì)外源ABA處理呈現(xiàn)超敏現(xiàn)象。擬南芥中與ACPK1同源性較高的AtCPK11，AtCPK4基因完全敲除(T-DNA插入)突變體atcpk11-1，atcp