葡萄果實中ACPK1蛋白激酶的基因克隆和功能的初步鑒定.pdf

1、本實驗以巨峰葡萄(Vitisvinifera×VitislabruscaL.cvKyoho)果實為材料，根據(jù)本實驗室鑒定的脫落酸(abscisicacid,ABA)激活的鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinase，CDPK)ACPK1(ABA-stimulatedcalcium-dependentproteinkinasel,ACPK1)的測序結(jié)果設計合成簡并引物，利用RT-PCR(reversetra

2、nscription-polymerasechainreaction)和RACE(rapidlyamplificationofcDNAends)技術克隆得到編碼此蛋白的cDNA全長序列。cDNA全長為1714bp，在GenBank的注冊號為AY394009。此核苷酸序列具有完整的開放閱讀框，編碼區(qū)長1491bp。經(jīng)相關軟件分析，ACPK1基因編碼一個由496個氨基酸組成的多肽，分子量為56kDa，其氨基酸序列與馬鈴薯(Solanumtu

3、berosum)，蠶豆(Viciafaba)，大豆和大豆種子(Glycinemax,Glycinemaxseed)，擬南芥(Arabidopsisthaliana)CPK12，水稻(Oryzasativa)，玉米(Zeamays)中的CDPKs分別有83％，81％，81％，77％，76％，76％的同源性。ACPK1具有N端可變域，激酶域，連接域和EF手形鈣結(jié)合域的典型CDPKs的結(jié)構特征。ACPK1的氨基酸序列中包含5個豆蔻?；稽c，在

4、213～231位氨基酸處有一跨膜結(jié)構。以α-32P標記ACPK1基因的cDNA全長為探針檢測顯示，ACPK1在葡萄基因組中可能有兩個拷貝。 分別構建原核表達載體pGEX-4T/ACPK1L(cDNA全長載體)和pGEX-4T/ACPK1-N10(編碼N端40個氨基酸的cDNA片段載體)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-o-galactopyranoside，IPTG)誘導

5、后產(chǎn)生了83kDa的ACPK1L融合蛋白和31kDa的ACPK1-N40融合蛋白。ACPK1L融合蛋白表現(xiàn)出依賴Ca2+的膠內(nèi)自磷酸化活性、電泳遷移率的變化以及組氨酸底物磷酸化活性，W7[N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide]抑制ACPK1L的自磷酸化活性和底物磷酸化活性，CaM和W5[N-(6-aminohexyl)-1-naphthalenesulfonamide]對A

6、CPK1L的自磷酸化活性和底物磷酸化活性沒有抑制作用。表明ACPK1基因編碼的產(chǎn)物是一個有活性的CDPK。兩種融合蛋白經(jīng)純化后制備抗體血清，根據(jù)酶聯(lián)免疫分析(linkedimmunosorbentassay,ELISA)、抗原滴度檢測(Proteindotblot)和Western-blot檢測，表明制得的抗體血清對ACPK1具良好的特異性和較高的檢測靈敏度。 經(jīng)實驗證實ACPK1在葡萄果肉和種子中特異表達，并呈現(xiàn)不同發(fā)育時期的

7、表達差異。不同時期的表達差異與內(nèi)源ABA濃度呈正相關。應用外源ABA溫育葡萄果實圓片的實驗體系證實，ABA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平激活ACPK1，且激活效應具溫育時間和ABA劑量的依賴性。 ACPK1基因在擬南芥中高效表達植株(ACPK1ox)較同期野生型植株高大，其種子萌發(fā)和幼苗生長對外源ABA處理呈現(xiàn)超敏現(xiàn)象。擬南芥中與ACPK1同源性較高的AtCPK11，AtCPK4基因完全敲除(T-DNA插入)突變體atcpk11-1，atcp