家蠶Ssu72蛋白基因的初步研究.pdf

1、Ssu72(Suppresso.o.sua7-.clon.2)蛋白的命名源于它對(duì)酵母的sua7-1基因突變的抑制作用。該蛋白具有很高的保守性，但在細(xì)菌或者古細(xì)菌中沒有發(fā)現(xiàn)Ssu72的同源物，所以Ssu72蛋白很可能是真核生物所特有的一種蛋白質(zhì)。目前關(guān)于Ssu72蛋白的研究有很多，推測(cè)它在真核生物RNA聚合酶II作用的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中有可能具有重要的功能：涉及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的選擇；具有磷酸酶的活性；與剪切和多聚腺苷酸化因子(cleavag.an.

2、polyadenylatio.factor.CPF)相結(jié)合；平衡轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)和終止等。但Ssu72蛋白確切的功能和作用機(jī)理仍不清楚。
　　 我們從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹期cDNA文庫(kù)中篩選到一條序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)此序列包含一個(gè)57.bp的開放閱讀框(ope.readin.frame，ORF)，編碼一個(gè)由192個(gè)氨基酸組成的蛋白，預(yù)測(cè)分子量為22.3.kDa，等電點(diǎn)為5.04。由于其所編碼的蛋白含有一個(gè)完整的Ssu72

3、保守結(jié)構(gòu)域，且與其它物種的Ssu72蛋白有很高的同源性，所以將家蠶中的這個(gè)基因命名為BmSsu72。通過(guò)PCR擴(kuò)增得到BmSsu72基因的完整ORF序列，將其插入到pET-28a(+)表達(dá)載體的Bam.I和Xh.I酶切位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒pET-28a(+)-BmSsu72。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)含有His標(biāo)簽的BmSsu72融合蛋白，分子量為25.9.kDa，與理論分子量大小一致。對(duì)重組菌超聲

4、破碎，用鎳親和柱純化得到較純的蛋白。用純化的蛋白作為抗原免疫一只雄性新西蘭大白兔，獲得多克隆抗血清，間接ELISA法測(cè)得抗體效價(jià)達(dá)1：12800以上。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)家蠶卵、五齡幼蟲、蛹、蛾四個(gè)不同發(fā)育時(shí)期及五齡幼蟲的不同組織中BmSsu72的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，BmSsu72基因的轉(zhuǎn)錄逐漸降低，五齡幼蟲各個(gè)組織中的轉(zhuǎn)錄以馬氏管和絲腺最高。利用Wester.blotting技術(shù)分析家蠶五齡幼蟲的氣管、絲