石斛AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子的基因克隆與功能初步分析.pdf

1、石斛屬（Dendrobium）植物是蘭科的附生植物，它是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，并且它還具有較高的觀賞價(jià)值。AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子是一類非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，該家族成員都含有1-2個(gè)高度保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答密切相關(guān)。
　　 本研究從石斛文庫(kù)中篩選得到3條AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子cDNA，分別命名為TEREB5、JEREB1和AP1，其中本文的主體研究對(duì)象為TEREB5。根據(jù)TERE

2、B5已知的序列信息設(shè)計(jì)特異引物，運(yùn)用5’RACE法克隆得到長(zhǎng)度為265bp的5’端序列，拼接得到完整序列。序列分析表明，TEREB5具有一個(gè)558bp的開放閱讀框，編碼186個(gè)氨基酸殘基，含有一個(gè)AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域，其序列經(jīng)Blast軟件進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子基因與葡萄的ERF7基因( XM_002282279.1)、大豆ERF5基因(HQ896930.1)和擬南芥ERF9基因（NC_003076.8）分別具有81％、

3、78％和75％的同源性。因此TEREB5屬于ERF亞族轉(zhuǎn)錄因子基因。采用Gateway法構(gòu)建TEREB5的超表達(dá)和RNA干涉載體，并分別轉(zhuǎn)化擬南芥，利用Barstar和Genotyping對(duì)T1和T2代擬南芥進(jìn)行篩選獲得陽(yáng)性植株。陽(yáng)性植株的表型產(chǎn)生變化，RNAi擬南芥植株體積增大，葉柄變長(zhǎng)，葉片變大，葉形較圓；超表達(dá)擬南芥植株體積縮小，葉柄變短，葉柄與葉片的分界較為模糊，葉形呈細(xì)長(zhǎng)狀，推測(cè)TEREB5可能在擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育中起到一個(gè)負(fù)調(diào)

4、控的作用。RNAi擬南芥的葉綠素含量高于野生型擬南芥，而超表達(dá)擬南芥的葉綠素含量又略低于野生型擬南芥，猜測(cè)TEREB5可能對(duì)葉綠素合成有影響，并且可能對(duì)葉綠素合成有一定的抑制作用。通過(guò)Real-time PCR分析，TEREB5的超表達(dá)會(huì)導(dǎo)致擬南芥同源基因ERF9的表達(dá)量出現(xiàn)一定程度的降低，推斷TEREB5可能與同源基因ERF9存在功能互補(bǔ)。在RNAi擬南芥植株中TEREB5的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致擬南芥同源基因ERF9的表達(dá)量出現(xiàn)明顯降低，說(shuō)明T