兩個(gè)棉花AP2-EREBP基因的鑒定及功能研究.pdf

1、棉花是世界上一種重要的的經(jīng)濟(jì)作物，產(chǎn)量高，成本低，在許多國家都有進(jìn)行大面積的種植，如我國、印度和美國等。棉花是重要的油料作物，又是主要的纖維作物，同時(shí)也是紡織業(yè)和化工業(yè)的重要原料來源。因此，分離鑒定出那些與棉纖維發(fā)育相關(guān)的基因，研究它們的表達(dá)模式以及功能，對于提高棉花產(chǎn)量及改良纖維品質(zhì)具有重要的意義。
　　AP2/EREBP蛋白是植物體內(nèi)的一類轉(zhuǎn)錄因子，對植物的生長發(fā)育具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。AP2/EREBP家族至少含有一個(gè)高度

2、保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，根據(jù)所含的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域個(gè)數(shù)，分為AP2亞家族（含兩個(gè)）和EREBP亞家族（含一個(gè)）。目前一些關(guān)于AP2/EREBP基因的研究報(bào)道表明，AP2亞家族的研究集中在花的發(fā)育和側(cè)根的發(fā)育方面，而EREBP亞家族的研究則主要集中在脅迫應(yīng)答和抗性方面。而對于EREBP亞家族與棉花纖維生長發(fā)育方面的影響卻少有報(bào)道。因此，有必要進(jìn)一步研究該類基因的作用機(jī)理和信號傳遞途徑，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供更多可靠的理論依據(jù)。

3、
　　我們從棉花cDNA文庫中篩選了兩個(gè)編碼AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子的基因，命名為GhERF1和GhRAP2.1。對其表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位以及功能進(jìn)行了研究,取得了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.GhERF1和GhRAP2.1基因的分離鑒定與進(jìn)化分析
　　從棉花的cDNA文庫中分離鑒定了2個(gè)編碼AP2/EREBP的基因，命名為GhERF1和GhRAP2.1。GhERF1的cDNA開放閱讀框(ORF)為678bp，編碼的蛋白質(zhì)

4、由226個(gè)氨基酸組成。GhERF1蛋白結(jié)構(gòu)包括一個(gè)AP2/EREBPdomain，且AP2/EREBPdomain內(nèi)的第14位為A和第19位為D，屬于ERF家族成員。進(jìn)化分析表明，GhERF1蛋白與楊樹PtERF32蛋白、擬南芥AtERF1蛋白的同源性較高，親緣關(guān)系較近。GhRAP2.1的cDNA開放閱讀框(ORF)為462bp，編碼的蛋白質(zhì)由154個(gè)氨基酸組成。GhERF1蛋白結(jié)構(gòu)包括一個(gè)AP2/EREBPdomain，且AP2/ER

5、EBPdomain內(nèi)的第14位為V和第19位為E，屬于DREB家族成員。進(jìn)化關(guān)系分析表明，GhRAP2.1與楊樹PtDREB35、蓖麻RcDREB1B及擬南芥AtRAP2.1、AtRAP2.9、AtRAP2.10同源性較高，親緣關(guān)系較近。
　　2.GhERF1和GhRAP2.1基因在棉花不同組織及纖維發(fā)育階段的表達(dá)分析
　　棉花不同組織表達(dá)分析結(jié)果顯示:GhERF1在棉花的根和纖維中優(yōu)勢表達(dá)，在其它組織中表達(dá)量很低或幾乎無表

6、達(dá)。GhRAP2.1在纖維、根、真葉中表達(dá)最高，下胚軸、花藥、子葉其次，在花瓣和胚珠中沒有表達(dá)。對這兩個(gè)基因在纖維不同發(fā)育階段的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明GhERF1在9DPA和12DPA纖維中表達(dá)量最高，GhRAP2.1在6DPA纖維中表達(dá)量最高。
　　3.棉花GhERF1基因在ACC，IAA，TIBA處理下的誘導(dǎo)表達(dá)
　　我們用ACC、IAA、TIBA對棉花10DPA離體胚進(jìn)行處理，通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析了GhERF1

7、基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，GhERF1的表達(dá)受到ACC、IAA、TIBA的影響，且在2h的時(shí)候就被迅速誘導(dǎo)。這些結(jié)果說明GhERF1可能參與了生長素信號途徑和乙烯信號途徑，同時(shí)也間接說明生長素信號途徑和乙烯信號途徑之間可能存在著交叉。
　　4.棉花AP2/EREBP蛋白的轉(zhuǎn)錄激活分析
　　將三個(gè)棉花GhAP2基因與PGBKT7載體相連后，轉(zhuǎn)化到AH109和Y187酵母菌株中，研究這三個(gè)GhAP2基因的轉(zhuǎn)錄激活活性。研究結(jié)果顯

8、示，GhERF1蛋白和另一個(gè)GhAP2蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活功能，而GhRAP2.1蛋白不具備轉(zhuǎn)錄激活功能。
　　5.GhERF1蛋白和GhRAP2.1蛋白的亞細(xì)胞定位分析
　　構(gòu)建了GhERF1:eGFP和GhRAP2.1:eGFP融合表達(dá)載體，通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥后，在共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光，結(jié)果顯示:GhRAP2.1定位于細(xì)胞核上。GhERF1的定位情況還需要繼續(xù)研究。
　　6.GhERF1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗

9、的表型分析
　　為研究GhERF1在植物中的功能，我們構(gòu)建了GhERF1過量表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化擬南芥后，獲得了5個(gè)Line的純合體，半定量分析顯示GhERF1基因在這5個(gè)Line中都有表達(dá)，選擇L10、L11、L17和L19為后續(xù)表型分析研究對象。
　　在黑暗情況下，GhERF1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的下胚軸和根長比野生型明顯要短一些;在光照情況下，GhERF1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的根長比野生型短。
　　7.IA

10、A和ACC對于GhERF1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀挠绊?br>　　用不同激素對GhERF1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)微量的IAA可部分回復(fù)ACC造成的過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)目減少的表型。說明GhERF1基因可能在乙烯信號途徑和生長素信號途徑的交叉過程中起到了一定的作用。
　　8.GhERF1可能通過IAA信號途徑來影響擬南芥?zhèn)雀陌l(fā)育
　　生長素對于植物側(cè)根的發(fā)育具有非常重要的作用。在MS+0nM

11、IAA的培養(yǎng)基上，GhERF1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的側(cè)根密度明顯比野生型要大。在MS+10nMIAA的培養(yǎng)基上，GhERF1過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的側(cè)根密度和野生型都有所升高，但過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的側(cè)根密度仍明顯比野生型要大。在MS+20nMIAA的培養(yǎng)基上，過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的側(cè)根密度下降，與野生型相比無明顯差異。在MS+30nMIAA、MS+50nMIAA、MS+100nMIAA的培養(yǎng)基上，過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗

12、的側(cè)根密度下降程度比野生型的大。表明在擬南芥?zhèn)雀陌l(fā)育過程，低濃度的生長素處理時(shí)，GhERF1促進(jìn)側(cè)根發(fā)育，高濃度生長素處理時(shí)，GhERF1抑制側(cè)根發(fā)育。
　　9.生長素應(yīng)答基因在GhERF1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的表達(dá)情況
　　分析了四個(gè)已被報(bào)道參與生長素應(yīng)答的基因(IAA1，IAA3,IAA9，IAA17,IAA19，SAUR）在GhERF1轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IAA1，IAA3在GhERF1過量表達(dá)株系中表達(dá)量明顯

13、下調(diào)，IAA9，IAA17,IAA19，SAUR在GhERF1過量表達(dá)株系中表達(dá)量明顯上調(diào)，推測GhERF1可能參與了生長素信號通路。
　　10.GhAP2RNAi轉(zhuǎn)基因棉花植株的獲得
　　構(gòu)建了GhAP2RNAi載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化，目前已獲得GhAP2RNAi轉(zhuǎn)基因棉花6個(gè)株系，共計(jì)30多株轉(zhuǎn)基因棉花植株;提取了3個(gè)株系的基因組DNA(gDNA)，PCR檢測表明100％為陽性苗。轉(zhuǎn)基因棉花植株的表型分析