蠟梅快速堿化因子基因CpRALF的克隆與功能初步分析.pdf

1、快速堿化因子(rapid alkalinization factor RALF)屬于多肽激素中的一類。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有:系統(tǒng)素(systemin)、植物磺化激動素(phytosulfokine PSK)、早期結瘤蛋白40(earlr nodulation ENOD40)、S位富含半胱氨酸蛋白(S-locuscysteine-rich protein SCR)、CLAVATA3及快速堿化因子(rapid alkalinization fa

2、ctorRALF)。系統(tǒng)素是在研究系統(tǒng)傷響應時鑒定的第一個多肽信號分子,之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他的幾種?？焖賶A化因子是2001年對煙草的系統(tǒng)素進行提取純化時偶然發(fā)現(xiàn)的,由于該蛋白能引起煙草懸浮細胞的培養(yǎng)基快速堿化,因此命名為快速堿化因子。有研究表明RALF有引起懸浮細胞培養(yǎng)基堿化、激活細胞內(nèi)MAPK(mitorgcn-activated protein kinase)、參與植物生長發(fā)育調(diào)控等生理作用研究表明外施RALF蛋白能夠抑制萌發(fā)種子的根的

3、伸長區(qū)和分裂組織、根毛缺失、分生細胞增大。有研究表明RALF能夠調(diào)控植物生長發(fā)育的方向及節(jié)奏,然而RALF是否參與植物的脅迫反應尚未出現(xiàn)相關報道。
　　 蠟梅(Chimonanthus praecox)是蠟梅科(Calycanthaceae)蠟梅屬(Chimonanthus)落葉叢生灌木,冬季開花并且耐寒、耐旱、耐剪。RALF是否參與其高效的逆境防御機制以及生長發(fā)育過程值得深入探討。本實驗從已構建好的蠟梅花cDNA文庫中克隆到一

4、個RALF序列,命名為CpRALF,Genebank登錄號為:JQ217379。對其序列分析;構建原核表達載體并使其在大腸桿菌中表達,并且對獲得的融合蛋白進行功能驗證;構建植物超表達載體;對CpRALF在蠟梅不同組織以及脅迫反應中的轉(zhuǎn)錄表達水平進行研究,主要的研究結果有:
　　 1、CpRALF的分子特征
　　 通過隨機挑選蠟梅花cDNA文庫測序,獲得了大小約為400bp的EST序列,然后通過RACE技術獲得cDNA全長

5、。BLASTX比對顯示,其與快速堿化因子蛋白具有較高的同源性,初步推斷所獲得的cDNA編碼快速堿化因子蛋白。獲得的cDNA序列中含有384bp的開放閱讀框,編碼蛋白長127個氨基酸。序列結構分析顯示,CpRALF編碼蛋白的C端含有快速堿化因子特有的YIXY、YXRGC基序以及四個半胱氨酸、雙精氨酸結構。
　　 2、CpRALF基因的原核表達及融合蛋白的活性檢測
　　 構建了CpRALF的原核表達載體pET32-CpRAL

6、F,并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)過IPTG誘導,得到了與預期一致的分子量為27KDa的融合蛋白。獲得的融合蛋白可以使煙草懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基輕微堿化,并且能抑制擬南芥根的生長。
　　 3、CpRALF基因的轉(zhuǎn)錄水平分析
　　 對CpRALF進行實時熒光定量PCR分析表明:CpRALF基因在蠟梅不同組織中表達有差異,根和盛開花中的表達量最高;在3輪花器官中的表達分析表明,在外瓣和雄蕊中的表達量最低,中瓣最高,內(nèi)瓣

7、、雌蕊低于中瓣并依次降低。不同花發(fā)育時期表達分析表明,蕾期和衰敗期的表達量最高,萌動期基本不表達,露瓣、初開、盛開的表達水平低于蕾期和衰敗期并呈現(xiàn)上升趨勢。對蠟梅幼苗進行脅迫處理后分析CpRALF基因的表達情況,結果表明,高鹽(NaCl)、重金屬(CuSO4)、高溫(42℃)脅迫會引起CpRALF表達量的升高,而低溫(4℃)脅迫則會抑制CpRALF的表達。并且CpRALF對高鹽和重金屬脅迫的響應比高溫和低溫脅迫的響應更為迅速和劇烈。表明