蠟梅快速堿化因子基因CpRALF的克隆與功能初步分析.pdf

1、快速堿化因子(rapid alkalinization factor RALF)屬于多肽激素中的一類。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有:系統(tǒng)素(systemin)、植物磺化激動素(phytosulfokine PSK)、早期結(jié)瘤蛋白40(earlr nodulation ENOD40)、S位富含半胱氨酸蛋白(S-locuscysteine-rich protein SCR)、CLAVATA3及快速堿化因子(rapid alkalinization fa

2、ctorRALF)。系統(tǒng)素是在研究系統(tǒng)傷響應(yīng)時鑒定的第一個多肽信號分子,之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他的幾種?？焖賶A化因子是2001年對煙草的系統(tǒng)素進行提取純化時偶然發(fā)現(xiàn)的,由于該蛋白能引起煙草懸浮細胞的培養(yǎng)基快速堿化,因此命名為快速堿化因子。有研究表明RALF有引起懸浮細胞培養(yǎng)基堿化、激活細胞內(nèi)MAPK(mitorgcn-activated protein kinase)、參與植物生長發(fā)育調(diào)控等生理作用研究表明外施RALF蛋白能夠抑制萌發(fā)種子的根的

3、伸長區(qū)和分裂組織、根毛缺失、分生細胞增大。有研究表明RALF能夠調(diào)控植物生長發(fā)育的方向及節(jié)奏,然而RALF是否參與植物的脅迫反應(yīng)尚未出現(xiàn)相關(guān)報道。
　　 蠟梅(Chimonanthus praecox)是蠟梅科(Calycanthaceae)蠟梅屬(Chimonanthus)落葉叢生灌木,冬季開花并且耐寒、耐旱、耐剪。RALF是否參與其高效的逆境防御機制以及生長發(fā)育過程值得深入探討。本實驗從已構(gòu)建好的蠟梅花cDNA文庫中克隆到一

4、個RALF序列,命名為CpRALF,Genebank登錄號為:JQ217379。對其序列分析;構(gòu)建原核表達載體并使其在大腸桿菌中表達,并且對獲得的融合蛋白進行功能驗證;構(gòu)建植物超表達載體;對CpRALF在蠟梅不同組織以及脅迫反應(yīng)中的轉(zhuǎn)錄表達水平進行研究,主要的研究結(jié)果有:
　　 1、CpRALF的分子特征
　　 通過隨機挑選蠟梅花cDNA文庫測序,獲得了大小約為400bp的EST序列,然后通過RACE技術(shù)獲得cDNA全長

5、。BLASTX比對顯示,其與快速堿化因子蛋白具有較高的同源性,初步推斷所獲得的cDNA編碼快速堿化因子蛋白。獲得的cDNA序列中含有384bp的開放閱讀框,編碼蛋白長127個氨基酸。序列結(jié)構(gòu)分析顯示,CpRALF編碼蛋白的C端含有快速堿化因子特有的YIXY、YXRGC基序以及四個半胱氨酸、雙精氨酸結(jié)構(gòu)。
　　 2、CpRALF基因的原核表達及融合蛋白的活性檢測
　　 構(gòu)建了CpRALF的原核表達載體pET32-CpRAL

6、F,并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo),得到了與預(yù)期一致的分子量為27KDa的融合蛋白。獲得的融合蛋白可以使煙草懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基輕微堿化,并且能抑制擬南芥根的生長。
　　 3、CpRALF基因的轉(zhuǎn)錄水平分析
　　 對CpRALF進行實時熒光定量PCR分析表明:CpRALF基因在蠟梅不同組織中表達有差異,根和盛開花中的表達量最高;在3輪花器官中的表達分析表明,在外瓣和雄蕊中的表達量最低,中瓣最高,內(nèi)瓣

7、、雌蕊低于中瓣并依次降低。不同花發(fā)育時期表達分析表明,蕾期和衰敗期的表達量最高,萌動期基本不表達,露瓣、初開、盛開的表達水平低于蕾期和衰敗期并呈現(xiàn)上升趨勢。對蠟梅幼苗進行脅迫處理后分析CpRALF基因的表達情況,結(jié)果表明,高鹽(NaCl)、重金屬(CuSO4)、高溫(42℃)脅迫會引起CpRALF表達量的升高,而低溫(4℃)脅迫則會抑制CpRALF的表達。并且CpRALF對高鹽和重金屬脅迫的響應(yīng)比高溫和低溫脅迫的響應(yīng)更為迅速和劇烈。表明