同時檢測美洲型及歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒多重RT-PCR方法的建立與應用.pdf

1、為了建立豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的快速鑒別檢測方法，本研究針對PRRSV的基因序列設計并合成3對特異性引物，分別為CO-ORF7、EU-ORF5和AM-Nsp2；利用CO-ORF7擴增美洲型和歐洲型毒株ORF7基因433 bp/398 bp片段；利用AM-Nsp2擴增美洲型經(jīng)典毒株和變異毒株Nsp2基因338 bp/248 bp片段；利用EU-ORF5擴增歐洲型毒株ORF5基因614 bp片段。經(jīng)過反應條件的優(yōu)化，成功建立了

2、能同時檢測并區(qū)分美洲型經(jīng)典毒株、高致病性變異毒株以及歐洲型毒株的多重RT-PCR檢測方法。該方法可以特異擴增PRRSV對應的基因片段，而與豬瘟病毒(CSFV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)均無交叉反應；對重組質粒標準品的檢出下限為1.67×103拷貝/μL；在相同條件下進行的重復試驗可獲得均勻一致的結果。應用檢測PRRSV的多重RT-PCR方法對臨床采集的176份疑

3、似病料進行檢測，結果PRRSV陽性45份，其中美洲型變異毒株41份、經(jīng)典毒株4份，未檢測到歐洲型毒株。
　　 針對臨床上PRRSV和CSFV混合感染時有發(fā)生的情況，為建立能同時檢測CSFV和PRRSV的方法，針對CSFV和PRRSV的基因序列設計3對特異性引物，即CSF-NS2、AM-Nsp2、EU-ORF5。其中，CSF-NS2擴增CSF毒株NS2基因508 bp片段，AM-Nsp2擴增PRRS美洲型經(jīng)典毒株和變異毒株Nsp2

4、基因338 bp/248 bp片段，EU-ORF5擴增PRRS歐洲型毒株ORF5基因614 bp片段。經(jīng)過反應條件的優(yōu)化，建立了能同時檢測并區(qū)分CSF毒株和PRRS美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株及歐洲型毒株的多重RT-PCR方法。該方法可以特異擴增CSFV和PRRSV，而與FMDV、PRV、PPV、PCV2均無交叉反應；對CSFV和PRRSV4種重組質粒標準品的檢出下限均為1.67×103拷貝/μL。應用該方法對采集的106份臨床疑似病料進行

5、檢測，結果CSFV和PRRSV變異株混合陽性4份，占3.77％(4/106)；CSFV陽性7份，占6.60％(7/106)；PRRSV變異株陽性17份，占16.04％(17/106)。
　　 本研究成功建立了的兩種檢測PRRSV的多重RT-PCR方法，一是同時檢測美洲型及歐洲型PRRSV的多重RT-PCR方法，二是同時檢測CSFV及美洲型、歐洲型PRRSV的多重RT-PCR方法，為PRRSV和CSFV的臨床快速鑒別檢測和流行病學