馬立克氏病病毒感染雞羽髓蛋白質組學研究.pdf

1、馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)分為馬立克氏病病毒血清1型(Marek'sdisease virus serotype1,MDV1)、血清2型(Marek's disease virug serotyoe2,MDV2)和火雞皰疹病毒(Turkey herpesvirus,HVT)3個血清型,僅MDV1型對雞有致病性。MDV1屬于皰疹病毒科禽皰疹病毒2型,引起以雞免疫功能障礙、惡性淋巴腫瘤和中樞神經系統(tǒng)

2、損傷為特征的馬立克氏病(Marek’s diseas,MD),是雞的重要傳染病。馬立克氏病同時也是首個通過疫苗進行控制的腫瘤性疾病,因此受到醫(yī)學界、獸醫(yī)學界、病毒學界的廣泛關注。
　　 MDV具有嚴格的細胞結合性,感染的細胞至少有4種類型,即B細胞、T細胞、巨噬細胞及羽毛囊和腎的上皮細胞。但羽髓上皮細胞(Feather follicl epithelium,FFE)是MDV唯一能夠形成游離的有囊膜的病毒粒子的部位。大量有囊膜的感

3、染性病毒粒子伴隨羽屑的脫落釋放到環(huán)境中成為傳染源。羽髓(Feather pulp)對于MDV的復制、裝配和MD的傳播流行具有重要意義,因此感染MDV羽髓組織的相關研究已成為MD的研究熱點之一。但目前此類研究大多從DNA或mRNA水平上進行個別基因或蛋白的檢測。蛋白質組學技術可以大規(guī)模鑒定蛋白質,更真實地反映蛋白質的表達情況。本文建立了適宜羽髓組織蛋白樣品的雙向電泳方法,對感染MDV強毒雞羽髓進行蛋白質組學分析,并對感染不同毒力MDV毒株

4、雞羽髓組織差異蛋白質組學進行研究。
　　 1.建立雞羽髓蛋白雙向電泳方法
　　 以SPF雞羽髓組織為研究對象,以固相pH梯度膠條進行等電聚焦為第一向,采用垂直十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠電泳為第二向進行雙向電泳。對上樣量、不同pH范圍膠條、一向設置參數(shù)、凝膠染色方法等進行一系列優(yōu)化。結果顯示羽髓組織在pH3-10范圍13 cm的2-DE膠上可以得到較好的分離效果,采用R350熱考染染色效果較好。應用軟件對凝膠圖譜進行初

5、步分析,可分辨的蛋白點約700個,不同樣本間的匹配率大于80％。本研究建立了適宜雞羽髓蛋白的雙向電泳方法,分辨率及可重復性均較高。該方法的建立為羽髓組織蛋白質組學研究提供了可靠的技術基礎。
　　 2.強毒力MDV感染雞羽髓差異蛋白質組學研究
　　 針對MDV從感染到發(fā)病的四個階段,利用雙向電泳技術對感染MDV強毒株后4d、7d、14d和21d羽髓組織蛋白的差異表達情況進行分析。結果顯示在MDV感染后四個時期各有顯著差異表

6、達蛋白點分別為2個、8個、25個和9個；通過質譜技術鑒定出29種蛋白質,包括能量代謝相關蛋白、增殖和凋亡相關蛋白、細胞骨架蛋白、信號傳導蛋白、轉錄相關蛋白、免疫相關蛋白和其他功能蛋白。鑒定的諸多種差異表達蛋白為進一步揭示羽髓中MDV的復制、基因的表達以及宿主的應答等打下基礎。
　　 3.強、弱毒株感染雞羽髓差異蛋白質組學研究
　　 針對MDV強、弱毒株的感染可能引起宿主細胞在蛋白水平上的表達情況不同。采用雙向電泳技術,將

7、MDV強毒GA株和弱毒疫苗株CVI988感染的羽髓蛋白樣品分別進行雙向電泳分離；并分析在MDV復制的四個階段,強、弱毒株感染后引起宿主蛋白差異表達情況。結果顯示感染后7d檢測到4個顯著差異表達蛋白點,其中相對于疫苗株CVI988感染組,GA株感染后上調表達2個,下調表達2個。感染后14d檢測到6個顯著差異表達蛋白點,相對于同時期疫苗株CVI988感染組,這些蛋白點在GA株感染時全部上調表達。感染后21d檢測到5個顯著差異表達蛋白點,其中

8、相對于疫苗株CVI988感染,GA株感染后上調表達4個,下調表達1個。利用質譜技術鑒定出7個蛋白點代表5種蛋白質分別是:LASP-1、heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like、L-乳酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶和甲硫腺苷磷酸化酶；對于進一步揭示MDV致病機制上的差異及與宿主相互作用關系上的差異等研究具有重要提示作用。
　　 本研究通過雙向電泳和質譜相結合的技術對感染MDV雞羽髓蛋白