雞馬立克氏病病毒TaqMan探針雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、馬立克氏病(MD)是雞的一種高度傳染性、淋巴組織增生性疾病。該病廣泛流行是嚴(yán)重危害家禽的傳染病之一。致病因子為馬立克氏病病毒(MDV)，屬α-皰疹病毒，包括1、2、3三種血清型，抗原有血清學(xué)交叉反應(yīng)。MDV常與其它病原混合感染、活苗免疫的干擾以及MD的亞臨床感染，加大了該病診斷、鑒別診斷及監(jiān)測(cè)的難度。MD是迄今為止唯一可用疫苗預(yù)防的腫瘤性疾病，目前活疫苗免疫仍是預(yù)防該病的主要手段，疫苗的質(zhì)量控制和免疫效果，是成功的預(yù)防該病發(fā)生的關(guān)鍵。M

2、D疫苗包括單價(jià)及多價(jià)疫苗，均為活疫苗。不同血清型疫苗毒在雞體內(nèi)的復(fù)制以及野毒感染的監(jiān)測(cè)是有效控制該病的關(guān)鍵。為解決這一問(wèn)題，本課題研究建立了雞MD三種血清型病毒的TaqMan探針雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于臨床診斷、三價(jià)苗的研制及疫苗免疫監(jiān)測(cè)。 據(jù)已發(fā)表三種血清型病毒的特異性基因序列：Meq基因、DNA聚合酶基因、SORFI基因，雞的管家基因卵鐵轉(zhuǎn)蛋白基因，設(shè)計(jì)并合成四對(duì)引物，四條TaqMan探針

3、：將PCR擴(kuò)增的特異片段分別克隆入T載體，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH鼬中。鑒定后的重組質(zhì)粒，作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品用于雙重FQ-PCR的建立。進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增，獲得了標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行了該方法的敏感性、特異性、重復(fù)性試驗(yàn)研究，初步建立了MDV的雙重FQ-PCR檢測(cè)方法。在國(guó)內(nèi)首次將建立雙重FQ-PCR方法應(yīng)用于臨床檢測(cè)，并與瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)和PCR結(jié)果相比較。FQ-PCR檢測(cè)MD發(fā)病雞只的陽(yáng)性率高于AGP，達(dá)100％；該方法的靈敏度比常規(guī)PC

4、R高10-100倍，在單位細(xì)胞內(nèi)可靈敏地檢測(cè)到2.01-2.78個(gè)拷貝的病毒。第一次將該方法應(yīng)用于MD三價(jià)苗的研究，確定了制備疫苗時(shí)三種血清型病毒的有效接種范圍、最佳接種劑量及單位蝕斑的病毒載量。應(yīng)用FQ-PCR對(duì)單價(jià)苗、三價(jià)苗在雞體內(nèi)的增殖進(jìn)行免疫監(jiān)測(cè)。本試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)首次建立了MDV雙重FQ-PCR檢測(cè)方法，在量化的標(biāo)準(zhǔn)上對(duì)雞體內(nèi)的疫苗毒和強(qiáng)毒予以區(qū)別，可作為MD特異性診斷標(biāo)準(zhǔn)。具有特異性強(qiáng)、敏感性高、可在1.5-2h內(nèi)快速完成檢測(cè)的特