棉花黃萎病菌GFP標(biāo)記轉(zhuǎn)化子的特征及其病害的生物防治.pdf

1、棉花黃萎病(Cotton Verticillium Wilt)是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)侵染棉花引發(fā)的世界性棉花重要病害。它屬于土傳病害，具有分布廣、危害重、寄主范圍廣、傳播途徑多、存活時(shí)間久等特征。由于棉花黃萎病菌變異性較大，常因環(huán)境條件的影響而產(chǎn)生新的生理類型，給黃萎病的防治造成一定的困難。明確其侵染模式及致病機(jī)制可以為防治該病提供重要的理論基礎(chǔ)。綠色熒光蛋白(GFP)基因可以為侵染的研究提供方法和手

2、段，因此本實(shí)驗(yàn)研究了將GFP基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入棉花黃萎病菌中。同時(shí)作為土傳病害，利用木霉菌防治該病發(fā)生是一種重要的防治方法之一。本研究即從以上兩個(gè)方面著手進(jìn)行了相關(guān)研究，并取得如下主要結(jié)果：
　　 1.GFP基因在棉花黃萎病菌中的轉(zhuǎn)化
　　 首先對菌齡、裂解酶種類、酶解溫度、時(shí)間和穩(wěn)滲劑等方面進(jìn)行研究，優(yōu)化制備棉花黃萎病菌原生質(zhì)體的最佳條件，結(jié)果表明，在液體培養(yǎng)36h后，采用崩潰酶+裂解酶+蝸牛酶的混合組合物，以0.7mol/

3、L的NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，在30℃培養(yǎng)條件下酶解2.5h，可獲得最大原生質(zhì)體制備量。
　　 利用獲得的原生質(zhì)體，通過PEG介導(dǎo)法把含有綠色熒光蛋白(GFP)基因的表達(dá)載體pSilent-EGFP轉(zhuǎn)化進(jìn)棉花黃萎病菌。每1μg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化得到3-4個(gè)含GFP的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過連續(xù)繼代培養(yǎng)9代仍能發(fā)出穩(wěn)定而強(qiáng)烈的熒光，利用PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子基因組DNA，獲得與pEGFP上GFP基因大小相同的片段，表明GFP基因已成功轉(zhuǎn)入棉花黃萎

4、病菌基因組中且穩(wěn)定遺傳。再通過熒光檢測分析，轉(zhuǎn)化子菌株熒光表達(dá)強(qiáng)烈，在菌絲，分生孢子梗以及分生孢子中都可觀察到強(qiáng)烈的熒光，微菌核由于受黑色素影響，只能在初形成時(shí)觀察到較弱熒光。生物學(xué)性狀研究表明，轉(zhuǎn)化子菌株生長，菌落形態(tài)、生長速度、菌絲顏色、產(chǎn)孢量以及孢子形態(tài)等與野生菌株無明顯差異。
　　 2.木霉誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)及拮抗木霉篩選
　　 挑選了四株已在實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)中應(yīng)用的生防木霉菌株NF9、TC3、TY、P1，接種滅菌麥粒，待產(chǎn)

5、孢后，均勻撒于棉花種子周圍，使其可在棉花根部定殖。在棉花六至七真葉期，從莖部注射棉花黃萎病菌孢子懸浮液，接種十三天后觀察各棉花植株發(fā)病情況，進(jìn)行抗病性評價(jià)。結(jié)果顯示，與對照相比，種子經(jīng)過木霉處理的棉花對棉花黃萎病菌并無明顯抗性。
　　 進(jìn)一步對本實(shí)驗(yàn)室分離到的57個(gè)木霉菌株(包括上述四株)進(jìn)行了拮抗棉花黃萎病菌的篩選。通過對峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，幾乎所有菌株都沒有篩選到有明顯重寄生作用的菌株。但通過玻璃紙培養(yǎng)法篩選到代謝物對棉花黃萎病菌的