棉花黃萎病菌GFP標記轉化子的特征及其病害的生物防治.pdf

1、棉花黃萎病(Cotton Verticillium Wilt)是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)侵染棉花引發(fā)的世界性棉花重要病害。它屬于土傳病害，具有分布廣、危害重、寄主范圍廣、傳播途徑多、存活時間久等特征。由于棉花黃萎病菌變異性較大，常因環(huán)境條件的影響而產生新的生理類型，給黃萎病的防治造成一定的困難。明確其侵染模式及致病機制可以為防治該病提供重要的理論基礎。綠色熒光蛋白(GFP)基因可以為侵染的研究提供方法和手

2、段，因此本實驗研究了將GFP基因轉化進入棉花黃萎病菌中。同時作為土傳病害，利用木霉菌防治該病發(fā)生是一種重要的防治方法之一。本研究即從以上兩個方面著手進行了相關研究，并取得如下主要結果：
　　 1.GFP基因在棉花黃萎病菌中的轉化
　　 首先對菌齡、裂解酶種類、酶解溫度、時間和穩(wěn)滲劑等方面進行研究，優(yōu)化制備棉花黃萎病菌原生質體的最佳條件，結果表明，在液體培養(yǎng)36h后，采用崩潰酶+裂解酶+蝸牛酶的混合組合物，以0.7mol/

3、L的NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，在30℃培養(yǎng)條件下酶解2.5h，可獲得最大原生質體制備量。
　　 利用獲得的原生質體，通過PEG介導法把含有綠色熒光蛋白(GFP)基因的表達載體pSilent-EGFP轉化進棉花黃萎病菌。每1μg質粒DNA轉化得到3-4個含GFP的轉化子。轉化子經過連續(xù)繼代培養(yǎng)9代仍能發(fā)出穩(wěn)定而強烈的熒光，利用PCR擴增轉化子基因組DNA，獲得與pEGFP上GFP基因大小相同的片段，表明GFP基因已成功轉入棉花黃萎

4、病菌基因組中且穩(wěn)定遺傳。再通過熒光檢測分析，轉化子菌株熒光表達強烈，在菌絲，分生孢子梗以及分生孢子中都可觀察到強烈的熒光，微菌核由于受黑色素影響，只能在初形成時觀察到較弱熒光。生物學性狀研究表明，轉化子菌株生長，菌落形態(tài)、生長速度、菌絲顏色、產孢量以及孢子形態(tài)等與野生菌株無明顯差異。
　　 2.木霉誘導抗性試驗及拮抗木霉篩選
　　 挑選了四株已在實驗和生產中應用的生防木霉菌株NF9、TC3、TY、P1，接種滅菌麥粒，待產

5、孢后，均勻撒于棉花種子周圍，使其可在棉花根部定殖。在棉花六至七真葉期，從莖部注射棉花黃萎病菌孢子懸浮液，接種十三天后觀察各棉花植株發(fā)病情況，進行抗病性評價。結果顯示，與對照相比，種子經過木霉處理的棉花對棉花黃萎病菌并無明顯抗性。
　　 進一步對本實驗室分離到的57個木霉菌株(包括上述四株)進行了拮抗棉花黃萎病菌的篩選。通過對峙培養(yǎng)發(fā)現，幾乎所有菌株都沒有篩選到有明顯重寄生作用的菌株。但通過玻璃紙培養(yǎng)法篩選到代謝物對棉花黃萎病菌的