人工合成抗菌肽抑制棉花黃萎病菌的機制及應用研究.pdf

1、我國是全球最大的棉花生產(chǎn)國，同時也是最大的消費國。棉花的生產(chǎn)和創(chuàng)收對于我國的國民經(jīng)濟意義重大。然而根據(jù)國家統(tǒng)計局提供的數(shù)據(jù)，2010年全國棉花的總產(chǎn)量（596.1萬噸）和單產(chǎn)(1229kg/ha)均為近五年來最低。除去人力不可控的氣候災害的影響，棉花病害的發(fā)生是限制單產(chǎn)的主要因子。本研究的對象就是危害棉花最嚴重病害之一——黃萎病，該病是海關出入境的檢驗檢疫對象，困擾棉花產(chǎn)業(yè)幾十年，一直未找到理想的防治對策。植物轉基因抗病育種技術的不斷發(fā)

2、展，為棉花黃萎病的攻克開辟了新的途徑，國內(nèi)外不少學者也進行了相關的嘗試。遺憾的是，截止到目前仍然沒有一個抗病的轉基因株系轉化為品種。究其原因應該是轉化的外源抗病基因不夠理想，不能像蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素基因(BT)那樣強效。因此，分離和發(fā)現(xiàn)高效抗病的外源基因成為當前轉基因抗黃萎病棉花品種選育工作中亟需解決的問題。
　　 為此，本文以長江和黃河流域棉花兩大主產(chǎn)區(qū)的15種黃萎病菌為材料，精心設計并合成了20條不同類型的抗真菌多肽，通過

3、分析抗菌肽與不同黃萎病菌、抗菌肽與動物細胞、抗菌肽與棉花原生質體間的互作，篩選出能高效抑殺黃萎病菌、低毒性的小分子多肽;探討了抗菌肽抑制黃萎病菌的可能作用機制和在大腸桿菌生物反應器中原核表達該多肽的可行性。研究的主要結果如下:
　　 1.對來自長江和黃河流域兩大主產(chǎn)棉區(qū)的15種黃萎病菌的地方小種進行了系統(tǒng)研究，首先，通過菌落形態(tài)學觀察將不同的菌系按照其菌絲和微菌核的相對生長量分別劃分到菌絲型、菌核型和中間型，為直觀地初步判定不同

4、地方小種奠定了基礎;其次，利用4對特異引物對上述病菌材料進行了PCR分子鑒定，發(fā)現(xiàn)除枯萎病菌對照外，其他供試菌種均為大麗輪枝菌，并且部分為強致病力的落葉型菌系。苗期接種試驗表明，黃萎病菌可能的致病因子——毒素（蛋白-脂-多糖復合物）對棉苗有明顯的致萎活性，通過進一步比較試驗發(fā)現(xiàn)，棉苗的抗氧化酶系統(tǒng)對毒素和分生孢子液的響應模式存在明顯的差異，毒素處理后棉苗的反應更加迅速（特別是根部），同一處理的不同器官內(nèi)的防御酶活性變化也不相同。

5、　　 2.采用溫室鑒定和病圃鑒定相結合的方法，觀察了黃萎病菌在棉花上的發(fā)生與危害情況，并對本課題組現(xiàn)有的三系雜交棉材料進行了為期2年的調查鑒定。其中，2007年8月份30℃以上的月均溫度以及同期較高的旬均溫度導致田間發(fā)生了黃萎病隱癥的情況，直到8月底才出現(xiàn)較高的病情指數(shù)。2008年田間病田的發(fā)病比較嚴重（同期溫度較2007年低很多，雨水足，適宜發(fā)?。?。比較不同時期、不同材料的田間發(fā)病規(guī)律，結論是未發(fā)現(xiàn)免疫水平的材料。本試驗用到的16個

6、三系雜交棉材料可以劃分為4個類群，海島棉恢復系具有高抗特性，雞腳葉恢復系和對照“湘雜棉2號”為高感病，其他多數(shù)材料均為耐病性或介于耐病與感病之間。相關性分析結果表明，各三系材料最終產(chǎn)量和纖維品質的表現(xiàn)與黃萎病的發(fā)病程度相關顯著。陸地棉雜交種和海陸雜種F1組合的各項指標均有所改良，但未表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢。
　　 3.收集國內(nèi)外各種數(shù)據(jù)庫和文獻報道的抗菌肽序列1500多條，找出有抗真菌特性的600條，最終選定20條為母體肽，分別利

7、用不同的抗菌肽修飾手段，對母體肽進行加工修飾，保留其保守的抗菌核心區(qū)（或氨基酸殘基），得到新型的潛在抗黃萎病菌多肽20條，體外人工合成后進行抑菌試驗。結果表明，不同的抗菌肽對黃萎病菌的作用差異很大，同一抗菌肽對不同的黃萎病菌小種之間也存在差異。經(jīng)過篩選得到抗菌肽θ-防御素類BTD-S和雜合肽CM-S可以分別抑制全部5種或其中4種供試黃萎病菌，并且最小抑菌濃度均在5μM以下，二者均表現(xiàn)了很強的抑菌能力，比目前研究利用最成熟的多肽D4E1效

8、果好(MIC=9.61μM)，而且抑菌力更持久。分別用綿羊血紅細胞和棉花原生質體為材料，對BTD-S和CM-S的生物安全性進行了評定，結果表明，二者僅在濃度達到200μg/ml時才會出現(xiàn)輕微的溶血性，對棉花原生質體在200μg/ml時未發(fā)現(xiàn)毒害性。
　　 4.通過生物信息學分析得出BTD-S為β-折疊肽，CM-S為α-螺旋肽。隨后利用圓二色譜技術測定了2種多肽分子的二級結構，BTD-S在遠紫外區(qū)的CD譜特征為195 nm處正峰，

9、205 nm處負峰，為典型的β-折疊構象;CM-S則在190 nm處正峰，222 nm和208 nm處出現(xiàn)明顯的負峰，為α-螺旋構象，試驗測定的數(shù)據(jù)與軟件預測的結果完全一致。抗菌肽的高級結構分析表明，BTD-S分子內(nèi)6個半胱氨酸結合為3對二硫鍵，呈梯狀，整條多肽結構非常穩(wěn)定，為其持久殺菌特性提供了可能;CM-S為α-螺旋，帶7個凈正電荷，分子具有兩親特性（有明顯的疏水表面），這些特質使其更容易通過膜作用機制抑菌。
　　 5.在普

10、通光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，20μg/ml抗菌肽的處理會導致病菌分生孢子無法正常萌發(fā)，并出現(xiàn)部分小號細胞群體;利用熒光顯微技術觀察發(fā)現(xiàn)抗菌肽處理的真菌孢子細胞膜受到嚴重損傷，大分子碘化丙啶(PI)滲入病菌細胞內(nèi)部，細胞核被染色，經(jīng)熒光激發(fā)顯紅色;掃描電鏡(SEM)觀察抗菌肽對細胞形態(tài)的影響，BTD-S處理后真菌孢子不能萌發(fā)，細胞表面出現(xiàn)明顯的外滲物，甚至發(fā)生細胞的破裂和解體，CM-S處理后也見到類似的現(xiàn)象，由此可見，BTD-S和CM-S都能與病

11、原真菌細胞膜互作，改變膜的透性，進而使細胞內(nèi)必需物質外滲。流式細胞儀分析表明，BTD-S處理會使病菌細胞群體中逐漸分化出一批小號細胞，并且隨著BTD-S濃度的增加，該類小號細胞的群體呈明顯擴大趨勢，這一結果與光學鏡下的發(fā)現(xiàn)相吻合;另一方面隨著BTD-S處理劑量的加大，病菌細胞對PI的吸收顯著增強，即細胞受損傷（或死亡）程度逐漸加重。
　　 6.根據(jù)BTD-S的氨基酸序列反譯為DNA序列，將編碼DNA序列插入到原核表達載體pET3