棉蚜內(nèi)源性piggyBac轉(zhuǎn)座子的研究.pdf

1、PiggyBac轉(zhuǎn)座子屬于DNA型轉(zhuǎn)座子，以“剪切-粘帖”機(jī)制準(zhǔn)確轉(zhuǎn)座，并且專一性地插入"TTAA"四核酸靶位點(diǎn)。以piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化了多種不同生物，是目前為止適應(yīng)性最廣，應(yīng)用最普遍的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，因此piggyBac轉(zhuǎn)座子也成為轉(zhuǎn)基因研究的熱點(diǎn)之一。目前發(fā)現(xiàn)piggyBac轉(zhuǎn)座子雖然廣泛分布于各類生物的基因組中，但活性轉(zhuǎn)座子卻極少發(fā)現(xiàn)。另由于非活性轉(zhuǎn)座子不斷累積變異，而活性轉(zhuǎn)座子僅有轉(zhuǎn)座酶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表

2、達(dá)，因此常規(guī)基因克隆很難發(fā)現(xiàn)具有完整結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)座子序列。但近期通過改進(jìn)轉(zhuǎn)座子克隆技術(shù)，相繼在不同鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)了完整轉(zhuǎn)座子。本文試圖以半翅目昆蟲棉蚜Aphis gossypii為材料，調(diào)查研究其基因組內(nèi)的piggyBac轉(zhuǎn)座子，發(fā)掘不同的活性轉(zhuǎn)座子，以便研究piggyBac轉(zhuǎn)座子的演化，揭示其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，進(jìn)而為開發(fā)高效轉(zhuǎn)基因載體，提供新途徑和新材料?，F(xiàn)將具體研究結(jié)果總結(jié)如下：
　　 ⑴利用反向PCR(I-PCR)技術(shù)和IT

3、R PCR，在棉蚜基因組中獲得了9條piggyBac類似因子序列，依次命名為：AgoPLE1.1、AgoPLE1.2、AgoPLE1.3、AgoPLE1.4、AgoPLE1.5、AgoPLE1.6、AgoPLE1.7、AgoPLE1.8、AgoPLE1.9。這9條序列在核酸序列上，相互之間具有很高的相似性。利用ORF-Finder程序分析發(fā)現(xiàn)，僅AgoPLE1.1具有完整的ORF框序列，能夠編碼含有577個氨基酸的轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座酶中同樣具

4、有piggyBac轉(zhuǎn)座酶典型的DDD-催化結(jié)構(gòu)域。序列比對發(fā)現(xiàn)，AgoPLE1.1的核酸序列與IFP2的核酸序列具有約38％的相似性，其推導(dǎo)的轉(zhuǎn)座酶序列與IFP2轉(zhuǎn)座酶序列具有47％的相似性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，AgoPLE1.1與目前報(bào)道的大多數(shù)鱗翅目昆蟲piggyBac類似因子聚為一類，與HyPLE1.1的轉(zhuǎn)座酶序列的相似性最高，達(dá)60％。
　　 ⑵利用AgoPLE1s序列中共有的保守序列，設(shè)計(jì)了一條DNA探針，檢測了棉蚜基因

5、組中AgoPLE1序列的可能拷貝數(shù)。Southern雜交結(jié)果顯示，在棉蚜基因組中至少有6份該類因子的拷貝。通過Genome Walking實(shí)驗(yàn)，克隆尋找了AgoPLE1s在棉蚜基因組上的5’端旁側(cè)序列，共獲得7條5’端旁側(cè)序列，其中4條仍保留了經(jīng)典的TTAA插入位點(diǎn)序列，其它3條旁側(cè)序列顯示靶位點(diǎn)發(fā)生了不同程度的變異。AgoPLE1s在棉蚜基因組中較少的拷貝數(shù)和較少的插入位點(diǎn)數(shù)；不同AgoPLE1序列之間具有很高的相似性，都表明棉蚜體內(nèi)

6、的AgoPLE1s具有共同的祖先，并且是較近年代才侵入并固定在棉蚜基因組中的。
　　 ⑶在果蠅S2細(xì)胞中利用二元轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立了棉蚜piggyBac類似因子的活性檢測方法，研究了棉蚜piggyBac類似因子AgoPLE1.1的活性。本研究首先證實(shí)了AgoPLE1.1的轉(zhuǎn)座酶能夠在S2細(xì)胞中精確地把Donor載體上的靶序列剪切下來。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)構(gòu)建了可供轉(zhuǎn)Blasticidin抗性基因的供體質(zhì)粒，利用這種供體質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

7、，再通過Blasticidin抗生素篩選轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞，以此來檢測AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座活性。試驗(yàn)結(jié)果顯示AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座酶對具有自身匹配末端反向重復(fù)序列和完整亞末端反向重復(fù)序列的供體質(zhì)粒，表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)座活性，進(jìn)一步證實(shí)了本研究在棉蚜中克隆獲得了具有天然轉(zhuǎn)座酶活性的piggyBac類似因子。但試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)顯示，AgoPLE1.1轉(zhuǎn)座酶不能轉(zhuǎn)座僅具有與自身匹配的末端反向重復(fù)序列，而沒有完整亞末端反向重復(fù)序列的供體質(zhì)粒，這一方

8、面證實(shí)了亞末端反向重復(fù)序列對轉(zhuǎn)座的重要性，另一方面也說明丟失亞末端反向重復(fù)序列很可能是AgoPLE1.1被固定在棉蚜基因組中的原因之一。
　　 ⑷利用二元轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在果蠅S2細(xì)胞中研究了轉(zhuǎn)座酶對不同piggyBac類似因子的末端反向重復(fù)序列(ITRs)的識別剪切作用。結(jié)果顯示，不同piggyBac類似因子的轉(zhuǎn)座酶只能識別和剪切合有自身ITRs序列的供體質(zhì)粒，而不能識別和剪切其他piggyBac類似因子ITRs序列構(gòu)建的供體質(zhì)粒。

9、由此說明，活性轉(zhuǎn)座酶只能識別剪切自身的ITRs序列而不能識別其它piggyBac類似因子的ITRs序列。這一研究結(jié)果表明，在利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因工具載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究時(shí)，可以通過選擇合適的載體系統(tǒng)來規(guī)避外源轉(zhuǎn)座子與宿主內(nèi)源性轉(zhuǎn)座子可能發(fā)生交互作用的風(fēng)險(xiǎn)，從而提高轉(zhuǎn)基因生物研究的安全性。
　　 ⑸調(diào)查了棉蚜體內(nèi)piggyBac類似因子基因，發(fā)現(xiàn)并獲得了具有天然轉(zhuǎn)座酶活性的新型piggyBac類似因子；利用二元轉(zhuǎn)化系統(tǒng)建立了新的轉(zhuǎn)