用轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)胸腺素α1(Tα1)的研究.pdf

1、胸腺素(thymosin)是Goldstein等(l966)首次從小牛胸腺中分離獲得的一組多肽類激素,包括10余種組分,其中組分(5thymosin fraction5,TF5)免疫活性最強(qiáng)。胸腺素α1(Tα1)是TF5中活性最強(qiáng)的一種多肽,由28個(gè)氨基酸殘基組成、分子量為3,108 Da和等電點(diǎn)為4.2。作為一種免疫調(diào)節(jié)劑,Tα1具有促進(jìn)T細(xì)胞發(fā)育、分化、成熟以及促進(jìn)產(chǎn)生特異抗體和細(xì)胞因子功能,臨床多被用于免疫缺陷、病毒感染和自身免疫

2、性疾病的治療,在肝炎(hepatitis B Virus,HBV和hepatitis C Virus,HCV)、艾滋病(human immunodeficiency virus,HIV)、癌癥(cancer)和糖尿病(diabetes)等疾病治療方面均取得了較好療效。目前,臨床用Tα1主要通過(guò)組織提取、化學(xué)合成或基因工程手段獲得,存在動(dòng)物胸腺來(lái)源有限、化學(xué)合成成本高和原核(細(xì)菌)或真核(轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)系統(tǒng)表達(dá)Tα1內(nèi)毒素、人畜共患病原污染

3、等安全問(wèn)題,限制了Tα1在臨床中的應(yīng)用。最近研究顯示,與傳統(tǒng)細(xì)菌、酵母或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)相比,用植物表達(dá)藥用蛋白在生產(chǎn)成本、規(guī)?；a(chǎn)和安全方面有優(yōu)勢(shì)。
　　基于此,為了探索Tα1生產(chǎn)新途徑,同時(shí)考慮到轉(zhuǎn)基因植物生物安全問(wèn)題,本研究構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體p35s::4×Tα1(帶twin T-DNAs);用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tabacum L.),得到了

4、如下結(jié)果:(1)按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成Tα1基因(124 bp),融合成4×Tα1,構(gòu)建了植物雙元表達(dá)載體p35s::4×Tα1(含twin T-DNAs)。(2)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉片,獲得kanamycin抗性煙草165株,PCR結(jié)果證實(shí)有17株轉(zhuǎn)4×Tα1基因陽(yáng)性煙草,陽(yáng)性率為10.3％。(3) Southern blot結(jié)果表明,17株P(guān)CR陽(yáng)性煙草有14株為獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株,4×Tα1整合到轉(zhuǎn)基因煙草基因組中的拷貝數(shù)介于1

5、(40＃)~7(12＃),而用nptII探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn),4×Tα1和nptII在轉(zhuǎn)基因煙草基因組中發(fā)生了分別整合;通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草T1代4個(gè)株系(177株)的4×Tα1和nptII PCR檢測(cè),我們獲得了2株僅整合有4×Tα1基因、而無(wú)篩選基因nptII的轉(zhuǎn)基因煙草。(4) Western blot結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)的4×Tα1具有免疫活性;ELASI結(jié)果顯示,4×Tα1在煙草葉片中表達(dá)量介于180.46(81＃)~756.87 n