胸腺素α1的克隆表達(dá)及其作用機理研究.pdf

1、人胸腺素αl(Tαl)是由是人體中樞免疫器官胸腺組織上皮細(xì)胞所分泌的一種免疫活性極強的多肽激素，起著加強免疫系統(tǒng)功能的作用，可以治療自身免疫疾病如慢性乙肝、丙肝、紅斑狼瘡等，還可作為治療癌癥的輔助藥物，在臨床上具有良好的療效。Tαl是由28個氨基酸組成的酸性多肽，等電點4.2，相對分子量3108。提取法和化學(xué)合成法是目前臨床所用的Tαl制劑的主要來源。組織提取法，受到材料來源的限制，產(chǎn)品中Tαl含量低，通常都是胸腺素多肽混合液，影響治療

2、效果；而化學(xué)合成方法，成本高，價格昂貴，限制了Tαl的臨床應(yīng)用。因此探索一條工業(yè)化生產(chǎn)Tαl的新工藝，不僅能滿足臨床的需要，而且為大量制備其他活性多肽具有指導(dǎo)意義。
　　 為了克服提取法與合成法的局限，我們試圖通過基因工程串聯(lián)表達(dá)法大量制備Tαl。本研究按照大腸桿菌慣用密碼子用人工方法合成Tal基因片段，經(jīng)退火及酶切、連接反應(yīng)獲取了Tαl六串體基因Tαl×6，定向克隆至pET-22b(+)表達(dá)載體的NdeI和HindⅢ位點之間，

3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經(jīng)測序鑒定正確的陽性克隆菌株在IPTG誘導(dǎo)下，融合蛋白Tαlx6得到了高效表達(dá)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明重組蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在。經(jīng)離心、洗滌包涵體及DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱層析，獲得了高純度重組蛋白。經(jīng)過在試管水平的培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)條件摸索后，我們成功地實現(xiàn)了該工程菌的高密度發(fā)酵，利用20 L發(fā)酵罐經(jīng)行中試，表達(dá)量達(dá)到0.9g/L。純化后的重組蛋白經(jīng)羥氨處理

4、，在Asn-Gly的Gly處發(fā)生裂解釋放出單體Tαl多肽。裂解產(chǎn)物用G-25凝膠柱層析分離，可以分別獲得未完全裂解多肽和Tαl單體多肽。質(zhì)譜測定結(jié)果顯示，裂解單體Tαl多肽與人工合成Tαl多肽分子量相差15，N-末端由天然的乙?；?yōu)镚ly。通過MTT實驗表明該裂解單體Tαl具有與化學(xué)合成品相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)活性，可以刺激小鼠淋巴細(xì)胞分裂增殖。
　　 獲得具有生物活性的重組Tαl，我們又對其體外活性進(jìn)行研究。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，T

5、αl作用于脾淋巴細(xì)胞時，能使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高、GSH水平降低，激活PKC，刺激細(xì)胞增殖。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，Tαl能使人肝癌HepG-2和肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞線粒體活性下降，細(xì)胞計數(shù)實驗發(fā)現(xiàn)HepG-2經(jīng)Tαl作用后細(xì)胞增殖受到抑制，而低濃度H2O2刺激HepG-2細(xì)胞增殖。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測，Tαl能降低HepG-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平、升高GSH水平，而H2O2作用正好相反。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Tαl通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，下調(diào)Ak

6、t信號通路來抑制HepG-2細(xì)胞的增殖；H2O2則通過升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，激活A(yù)kt使細(xì)胞增殖加快。PI染色檢測發(fā)現(xiàn)，Tαl降低HepG-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平導(dǎo)致細(xì)胞周期在G1期積累，細(xì)胞增殖減慢；Tαl升高脾淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高使細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變加快，細(xì)胞增殖加快。證明細(xì)胞周期的正常運行需要細(xì)胞內(nèi)ROS維持在一個正常的水平，Tαl可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響細(xì)胞周期。
　　 本研究成功構(gòu)建了一個Tαl六串體表

7、達(dá)載體pET-22b(+)-Tαl×6，并在大腸桿菌BL21(DE3)中得到表達(dá)，經(jīng)20 L發(fā)酵罐中試具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。重組蛋白經(jīng)羥氨特異性裂解獲得具有生物活性的Tαl單體蛋白，為大量生產(chǎn)Tαl滿足臨床需求開辟了新途徑。研究中發(fā)現(xiàn)Tαl能影響脾淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，進(jìn)而分別對兩種細(xì)胞內(nèi)的PKC和Akt信號通路產(chǎn)生影響；同時ROS水平的變化也對細(xì)胞周期產(chǎn)生影響，最終都導(dǎo)致細(xì)胞增殖的改變。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究Tαl的活性