豬圓環(huán)病毒2型感染PK-15細胞差異蛋白質組研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，基因組為單鏈環(huán)狀DNA。PCV2病毒基因組已經證明三個能夠編碼蛋白質ORF為：ORF1編碼復制相關蛋白(Rep)，ORF2編碼衣殼蛋白(Cap)，以及ORF3編碼ORF3蛋白。PCV2對豬的致病性主要體現在免疫抑制。本研究對PCV2感染PK-15細胞的差異表達蛋白及與PK-15細胞蛋白間相互作用進行分析，旨在探討PCV2在PK-15

2、細胞的復制與感染機制。
　　 1、PCV2感染性克隆的構建
　　 在自然感染PCV2豬群中，豬體能夠同時感染多種亞型的PCV2。對不同基因型的PCV2致病性進行研究，需要獲得純化的PCV2病毒。為了獲得純化的PCV2病毒，本研究通過克隆病毒全長基因組，并利用感染性克隆構建技術進行病毒遺傳拯救以及拯救病毒的細胞培養(yǎng)特性測定，試驗證明拯救的病毒與野生型病毒具有相似的復制能力。獲得純化的PCV2病毒為后續(xù)研究奠定基礎。

3、　　 2、PCV2感染PK-15細胞后差異表達蛋白鑒定
　　 用遺傳拯救的PCV2病毒粒子感染PK-15細胞，應用二維凝膠電泳結合質譜鑒定對感染的PK-15細胞進行蛋白質組學分析。二維凝膠電泳數據分析顯示，在PCV2感染PK-15細胞后，共有61個差異表達蛋白被發(fā)現。差異表達蛋白主要出現在PCV2感染PK-15細胞后48-96h。經過MALDI-TOF/TOF鑒定，共有44個差異表達蛋白點獲得成功鑒定，包括22個上調表達蛋白點

4、和22個下調表達蛋白點。22個上調表達蛋白點代表的18種蛋白是：蛋白酶體亞單位p40、NUP43蛋白、Ras相關蛋白Rap-2c、抑制素、3種肌動蛋白、微管蛋白、微絲相關蛋白、抗氧化蛋白4、抗氧化蛋白6、空泡離子泵亞單位B2、蛋白質磷酸激酶2亞型8、精氨酸脫亞氨酸酶、丙酮酸脫氫酶E1β亞基、異檸檬酸脫氫酶、酸性核蛋白體磷蛋白PO、酪氨酰tRNA合成酶。22個下調表達蛋白點代表的22種蛋白是：網素、中間絲相關蛋白、熱休克蛋白27、延伸因子

5、2、復制蛋白A2、嘌呤核苷磷酸化酶、鳥嘌呤單核苷酸合成酶、次黃嘌呤磷酸核苷轉移酶、三聯組氨酸、醛醇基轉移酶、半乳糖變旋光酶，肽基異構酶、異檸檬酸脫氫酶、α烯醇化酶、6磷酸葡萄糖酸內脂酶、磷酸葡萄糖變位酶、3'磷酸腺苷5'磷酸硫酸合成酶、蛋白酶體β3亞基、蛋白酶體激活復合物亞基1、SKP1等位基因G2抑制劑、SH2/SH3銜接蛋白、同源異形盒前圓蛋白。上調蛋白與細胞骨架、生物合成、脂蛋白代謝、泛素蛋白酶體途徑、信號轉導和基因調控相關。下調

6、蛋白與蛋白的轉錄和延伸、RNA的加工和合成、糖降解、氨基酸的轉運和代謝、泛素蛋白酶體途徑、信號轉到、基因調控相關。利用real time RT-PCR方法，在轉錄水平對質譜鑒定的20種差異表達蛋白進行了驗證，結果表明差異表達蛋白轉錄本變化與二維凝膠電泳中的變化趨勢呈部分一致。利用已有的單克隆抗體工具，借助Western Blot進一步驗證了細胞的β-actin、α-tubulin以及cytokeratin8，結果表明α-tubulin以

7、及cytokeratin8兩種蛋白的變化趨勢與二維電泳中兩種蛋白點變化趨勢一致。綜上所述，PCV2感染PK-15細胞以后，引起細胞內骨架相關蛋白、應激反應蛋白、生物合成相關蛋白、泛素蛋白酶體相關蛋白、信號轉到和基因調控相關蛋白的變化。
　　 3、PCV2衣殼蛋白與PK-15細胞蛋白α-tubulin相互作用的鑒定
　　 病毒編碼蛋白在細胞內的分布決定病毒復制的部位，為了鑒定PCV2編碼蛋白Rep和Cap在細胞內的亞胞定位

8、，本試驗通過構建Rep和Cap蛋白的重組真核表達載體轉染PK-15細胞以及PCV2病毒粒子感染PK-15細胞進行研究，結果顯示：Rep蛋白在感染后24h、48h定位在細胞核中，在72h少量Rep蛋白出現在細胞漿中。PCV2 Cap蛋白在感染后的24h定位在細胞核中，而48h和72h定位在細胞漿中。這表明PCV2在PK-15細胞復制過程中出現了Rep和Cap蛋白位移現象。細胞骨架對于細胞內的物質運輸具有重要作用，基于蛋白組學發(fā)現的細胞骨架