豬細(xì)小病毒感染對PK-15細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄時相影響的研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)是引起妊娠母豬繁殖障礙的主要病原體之一,可引起初產(chǎn)母豬產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬等,還可引起感染母豬不孕或反復(fù)發(fā)情,并普遍存在于國內(nèi)外的養(yǎng)殖場,嚴(yán)重影響和制約著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。細(xì)胞因子(Cytokine,CK)是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞活化后產(chǎn)生的高活性多功能的小分子多肽、糖蛋白或蛋白,具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答、抗腫瘤和抗病原微生物感染等多種生物學(xué)功能。為了進(jìn)一步了解

2、豬細(xì)胞因子對PPV感染的免疫反應(yīng)機(jī)制,更深入的闡明PPV的致病機(jī)理,進(jìn)行了以下研究:
　　 1利用實(shí)時定量PCR分別對PPV感染PK-15細(xì)胞后1 h、2 h、3 h、12 h、24 h、48 h、72 h細(xì)胞中的PPV DNA水平以及1 h、2 h、12 h、24 h、48 h、96 h時細(xì)胞中的IFN-β、IFN-γ、IFNAR-1、IFNAR-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、MX1、NOS、2-5OAS、RNaseL和IRF-

3、3等干擾素及相關(guān)細(xì)胞因子mRNA分泌水平進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PPV感染PK-15細(xì)胞后1 h即能檢測到PPV DNA,12 h后PPV開始迅速增殖,在感染后48 h達(dá)到峰值,為1800倍左右。IFN-β、IFN-γ、IFNAR-2、MHC-I、iNOS表達(dá)量在感染后1 h并未見增加,但在2 h時增加明顯,其中IFNAR-2達(dá)到未感染時的21倍左右,隨后表達(dá)水平逐步降低；IFNAR-1在1 h時基因表達(dá)量開始增加,在2 h達(dá)到高峰,隨后表

4、達(dá)水平開始下降；MHC-Ⅱ、Mx1表達(dá)在感染后12 h顯著增加,其中Mx1基因在24 h表達(dá)量達(dá)到8423倍,此后迅速下降；2-5OAS、RNaseL,在48 h達(dá)到高峰,其它時間表達(dá)差異不顯著；IRF-3在感染后1 h表達(dá)量顯著增加,達(dá)到97倍,在2 h和12 h仍增加顯著,48 h之后降低。
　　 2利用實(shí)時定量PCR分別對PPV感染PK-15細(xì)胞后1 h、2 h、12 h、24 h、48 h、96 h的細(xì)胞中的TNF-α、

5、TNFR2、Bcl-2、Bcl-x1、FasL,、p53、Caspase-8和PBR等凋亡相關(guān)細(xì)胞因子mRNA分泌水平進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPV感染PK-15細(xì)胞后TNF-a在2 h表達(dá)量明顯增加,達(dá)到15倍,隨著時間的延長表達(dá)量降低,在96 h后表達(dá)量變化不顯著；TNFR2在2h表達(dá)量顯著增加,自12 h后表達(dá)量降低明顯；Bcl-2 mRNA從12 h到48 h表達(dá)量明顯增加,96 h后變化不顯著:Bcl-x1在2 h時表達(dá)量顯著增加,

6、達(dá)到9.6倍,隨后逐漸降低；FasL,在12 h表達(dá)量增加顯著,24 h后表達(dá)量下降顯著；2 h時p53的表達(dá)量顯著增加,24 h后表達(dá)量變化不明顯；2 h時CaSpaSe-8表達(dá)量顯著增加,達(dá)到1.97倍,隨后逐漸降低；PBR表達(dá)量從2 h開始增加,24 h達(dá)到41倍之多,隨后表達(dá)量開始下降。
　　 3利用實(shí)時定量PCR分別對PPV感染PK-15后1 h、2 h、12 h、24 h、48 h、96 h的細(xì)胞中的IL—1β、2、

7、6、8、10、12p35、12p40、13、15、17和18等炎性細(xì)胞因子mRNA分泌水平進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPV感染PK-15細(xì)胞后在1 h時IL-1β、IL-8、IL-12P40的表達(dá)量明顯增加,在2 h時達(dá)到峰值,分別達(dá)到33倍、8倍、32倍；IL-6的表達(dá)量在1 h顯著增加,達(dá)到19倍,12 h后變化不顯著；IL-12P35表達(dá)量1 h時開始增加,12 h達(dá)到峰值；IL-13在2 h時表達(dá)量增加顯著,隨后逐漸下降；IL-17在P

8、PV感染后表達(dá)量顯著下降,甚至低于對照組細(xì)胞的表達(dá)量；IL-18基因在2 h表達(dá)量即顯著增加,隨后持續(xù)穩(wěn)定高效表達(dá)。PK-15細(xì)胞不分泌IL-2、IL-10及IL-15。
　　 4利用實(shí)時定量PCR分別對PPV感染PK-15后1 h、2 h、12 h、24 h、48 h、96 h細(xì)胞中MIP-1α、TGF-β1、PGK1和MURR1分泌水平進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MIP-1α在感染后1 h表達(dá)量即顯著增加,在2 h達(dá)到峰值,基因表達(dá)量

9、差異倍數(shù)為13倍；TGF-β1在感染后96 h表達(dá)變化量達(dá)到8.8倍,而在其余時間點(diǎn)檢測結(jié)果均無顯著變化；PGK1在感染后2 h的表達(dá)量即達(dá)到95倍之多,隨后開始下降,但仍高于對照組細(xì)胞的基因表達(dá)量；MURR1在感染后2 h即開始大量表達(dá),12 h達(dá)到81倍,24 h迅速達(dá)到301倍,48 h時仍為對照組細(xì)胞的基因表達(dá)量的12倍,至96 h無顯著變化。
　　 5利用實(shí)時定量PCR分別對不同感染復(fù)數(shù)PPV感染.PK-15后1 h、

10、2 h、12 h、24 h、48 h細(xì)胞中的IFN-β、IRF-3、TNF-α和IL-18分泌水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-β在感染后1h表達(dá)量開始增加,當(dāng)12 h且MOI=1時表達(dá)量增加顯著,達(dá)到11倍,此后開始下降；IRF-3在感染后1 h表達(dá)量顯著增加,在1 h且MOI=10時表達(dá)量達(dá)到967倍；TNF-α在1 h時表達(dá)量開始增加,在2 h且MOI=1時表達(dá)量的差異倍數(shù)達(dá)到96,48 h時表達(dá)量開始下降；IL—18從1 h到48 h持續(xù)表