豬瘟病毒高感染性PK-15細(xì)胞單克隆細(xì)胞株的篩選.pdf

1、豬瘟(Classical Swine Fever)，早期稱豬霍亂(HC)，是由豬瘟病毒(CSFV)引起豬的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，其特征為高熱稽留和全身廣泛性出血。豬瘟病毒(CSFV)屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus），是 RNA病毒，具有感染性。CSFV在豬體內(nèi)復(fù)制增殖，破壞機(jī)體多種細(xì)胞，使豬迅速發(fā)病并死亡。而在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，CSFV并不能使細(xì)胞產(chǎn)生病理變化。CSFV在體外增殖的病毒滴

2、度較低，而提高病毒滴度對(duì)研究CSFV的分子生物學(xué)特性和免疫學(xué)特性，以及制備CSFV單抗和疫苗都具有非常重要的作用。
　　豬瘟病毒是單股正鏈線性RNA病毒，ORF編碼一個(gè)由3898個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白，在病毒和宿主細(xì)胞酶的作用下，形成至少12種成熟的病毒蛋白。用于CSFV分子流行病學(xué)分析的核苷酸片段主要有NS5B、E2和5’UTR等，其中NS5B和E2可用來精確區(qū)分毒株。根據(jù)CSFV的NS5B、E2和E0基因分群的結(jié)果一致，初步認(rèn)

3、為這3個(gè)基因在系統(tǒng)發(fā)生分析中具有高度的一致性。本研究通過設(shè)計(jì)E0、E2和NS5B基因特異性引物，擴(kuò)增目的片段，然后通過測(cè)序及序列分析，確定使用的CSFV與shimen株同源性最高，為后續(xù)試驗(yàn)奠定背景基礎(chǔ)。
　　PK15細(xì)胞廣泛應(yīng)用于CSFV的分離與培養(yǎng)，但是其不均一性導(dǎo)致了病毒培養(yǎng)滴度不高。研究表明豬瘟病毒在體外培養(yǎng)中釋放的病毒的量與細(xì)胞感染數(shù)量（陽(yáng)性細(xì)胞）有關(guān)，所以提高細(xì)胞感染數(shù)量同時(shí)提高感染速度對(duì)提高病毒滴度有至關(guān)重要的作用。

4、研究顯示感染PCV2的PK15細(xì)胞培養(yǎng)物，約有20％PK-15細(xì)胞是PCV2易感的細(xì)胞群，該研究表明PK-15細(xì)胞的異質(zhì)性與PCV2滴度的高低有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過IPMA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CSFV對(duì)PK-15的感染也僅僅只有20％左右，所以獲得均一的PK-15細(xì)胞有助于提高CSFV滴度。CSFV病毒滴度，即50％組織細(xì)胞感染劑量（TCID50），得到每毫升PK15細(xì)胞培養(yǎng)通常從104到105不等。為了獲得均一的、針對(duì)培養(yǎng)CSFV高病毒滴度的PK

5、15細(xì)胞，本研究通過有限稀釋法對(duì)PK15親代細(xì)胞進(jìn)行克隆，獲得兩株P(guān)K15細(xì)胞克隆株，分別為PK15-1A6和PK15-3B1，與PK15親代細(xì)胞相比，PK15-1A6和PK15-3B1 TCID50分別能達(dá)到106.8TCID50/mL和103.61TCID50/mL，而PK15親代細(xì)胞的TCID50則為104.88TCID50/mL。PK15-1A6單克隆細(xì)胞株感染CSFV的強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PK15母細(xì)胞，為以后CSFV疫苗評(píng)價(jià)及診斷研