豬圓環(huán)病毒2型感染誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus-associated disease，PCVAD)的主要病原。PCV2屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬，其基因組是大小約為1.7 kb的單股共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，包含三個(gè)主要的開放閱讀框（open reading frames，ORFs），分別編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白（ORF1）、衣殼蛋白(ORF2)和凋亡相關(guān)

2、蛋白(ORF3)。PCV2是已知感染哺乳動(dòng)物的最小的病毒。病毒主要在淋巴組織中復(fù)制，造成淋巴組織消失和組織細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致豬的免疫抑制。免疫刺激或者與其他病原共同感染能加重疾病的發(fā)生。有關(guān)PCV2致病機(jī)理的研究已有較大進(jìn)展，但仍有一些重要的機(jī)制有待闡明。
　　細(xì)胞凋亡(apoptosis)可能是PCV2感染造成淋巴組織消失的機(jī)制之一。但是凋亡究竟是病毒蛋白如ORF3或衣殼蛋白（Cap）直接導(dǎo)致，還是通過自噬(autophagy)

3、或未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)間接導(dǎo)致并不明確。UPR、自噬和凋亡在細(xì)胞長期處于應(yīng)激狀態(tài)下能通過相似的信號通路連續(xù)發(fā)生，并最終決定細(xì)胞的命運(yùn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)在病毒的復(fù)制和成熟中起重要作用。病毒通過挾持細(xì)胞的翻譯機(jī)制在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔合成大量病毒蛋白或利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為復(fù)制場所，最終導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)。細(xì)胞通過誘導(dǎo)UPR來應(yīng)對應(yīng)激，或通過凋亡

4、來結(jié)束不能緩解的應(yīng)激。能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的病毒多為RNA病毒，PCV2能否誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未有報(bào)道，我們推測PCV2誘導(dǎo)的凋亡可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。
　　本研究旨在探明:(1) PCV2感染能否引起UPR，以及引起UPR的關(guān)鍵病毒蛋白;(2) UPR對病毒復(fù)制的影響;(3) PCV2引起細(xì)胞UPR與凋亡之間的聯(lián)系。
　　1.PCV2感染細(xì)胞能選擇性激活UPR的PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路
　　通過免疫印跡和

5、RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子GRP78和UPR三條分支PERK/elF2α、ATF6和IRE1α/XBP1，我們發(fā)現(xiàn)PCV2感染PK-15細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞均能上調(diào)GRP78，并選擇性激活PERK通路，ATF6和IRE1α/XBP1通路均不激活。促進(jìn)細(xì)胞存活的轉(zhuǎn)錄因子ATF4和促進(jìn)凋亡的CHOP蛋白在PCV2感染36-48 h后上調(diào)，同時(shí)伴隨大量病毒蛋白的產(chǎn)生。因此我們推測持續(xù)的PCV2感染能夠激活PERK/elF2α/ATF4

6、/CHOP信號通路。利用表達(dá)病毒編碼蛋白的真核載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，免疫印跡結(jié)果表明，PCV2 Rep和Cap蛋白能誘導(dǎo)UPR的PERK通路。
　　2.PCV2能夠利用PERK通路和分子伴侶GRP78增強(qiáng)其復(fù)制
　　利用PERK通路關(guān)鍵分子的抑制劑或RNA干擾研究UPR對Cap蛋白表達(dá)和PCV2復(fù)制的影響。免疫印跡和TCID50結(jié)果表明，抑制PERK磷酸化或抑制eIF2α去磷酸化能夠顯著減少PCV2的復(fù)制(TCID50∶ GSK26

7、06414∶4.58 vs2.88，P＜0.01; siPERK∶4.53 vs2.75,P＜0.01; Salubrinal∶4.49 vs2.25, P＜0.01)，表明PCV2可能利用PERK通路幫助其復(fù)制。通過真核表達(dá)載體或藥物誘導(dǎo)過表達(dá)GRP78或用化學(xué)分子伴侶?；切苋パ跄懰崽幚砟軌蛟鰪?qiáng)PCV2的復(fù)制(TCID50∶pcDNA3-GRP78∶4.03 vs5.13,P＜0.05; BIX∶4.13 vs5.12, P＜0.05

8、; thapsigargin∶2.90vs3.67，P＜0.05;TUDCA∶4.20 vs4.90，P＜0.05），而基因沉默GRP78則顯著降低Cap蛋白的表達(dá)和PCV2的復(fù)制（TCID50∶ siGRP78∶4.29 vs2.96，P＜0.05）。表明內(nèi)源性或外源性的伴侶分子可能幫助病毒蛋白正確折疊并促進(jìn)病毒的復(fù)制。
　　3.PCV2通過PERK/CHOP/Bcl-2通路引起細(xì)胞凋亡
　　由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起凋亡被認(rèn)為是一

9、些病毒的致病機(jī)理，如乙肝病毒感染;PCV2通過ORF3誘導(dǎo)凋亡尚有爭論。我們通過免疫印跡檢測凋亡關(guān)鍵分子，發(fā)現(xiàn)PCV2感染PK-15細(xì)胞后Bcl-2家族的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL明顯下調(diào)，caspase-3發(fā)生剪切;流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測凋亡也印證了PCV2感染能夠引起早期凋亡和DNA斷裂。通過化學(xué)分子伴侶緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠減少PCV2誘導(dǎo)的CHOP表達(dá)和caspase-3剪切，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡之間存在聯(lián)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

10、激造成感受器PERK的激活以及鈣離子外流可以介導(dǎo)內(nèi)源性線粒體途徑的凋亡，信號通路最終匯集至線粒體，并激活凋亡執(zhí)行者caspase-3。之前已證實(shí)PCV2感染選擇性激活UPR的PERK途徑以及誘導(dǎo)Ca2+通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3R受體外流至細(xì)胞質(zhì)，通過化學(xué)抑制劑或RNA干擾，我們發(fā)現(xiàn)抑制PERK或IP3R能夠減輕PCV2感染誘導(dǎo)的凋亡。PERK下游的促凋亡分子CHOP可以通過抑制Bcl-2誘導(dǎo)凋亡，通過基因沉默CHOP能部分回補(bǔ)Bcl-2水平

11、，說明PCV2感染可能通過PERK/elF2α/CHOP/Bcl-2途徑引起凋亡。為進(jìn)一步探明誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵病毒蛋白，我們利用病毒編碼蛋白真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果表明Cap能夠通過PERK/eIF2α/CHOP通路誘導(dǎo)Bcl-2下調(diào)和caspase-3剪切，說明Cap蛋白在PCV2感染誘導(dǎo)UPR，繼而引起凋亡中起關(guān)鍵作用。
　　綜上所述，本研究闡明了PCV2感染能夠誘導(dǎo)UPR，并通過PERK/eIF2α/ATF4/CHOP/Bc