豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、豬瘟是一種豬的高度接觸性傳染的病毒性疾病，嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，是我國(guó)豬的四大疫病之一。疫苗接種是控制豬瘟的重要手段，但采用弱毒疫苗對(duì)豬免疫后．很難區(qū)分被免疫和自然感染的豬，影響了豬瘟防治。而DNA疫苗能夠同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，因不存在活疫苗毒力反強(qiáng)的潛在危險(xiǎn)，已廣泛應(yīng)用于抗豬瘟病毒疫苗的研究。
　　 為了建立豬瘟血清學(xué)快速診斷的方法，開(kāi)發(fā)豬瘟新型疫苗，研究E2蛋白的功能，本文構(gòu)建了CSFV E2原核表達(dá)重組質(zhì)粒，

2、成功制備了鼠抗豬瘟病毒E2蛋白的多抗和單抗，建立了篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的間接ELISA方法，同時(shí)也建立了鑒定單抗特性的方法，可望在豬瘟的預(yù)防與控制中發(fā)揮重要作用。
　　 首先，根據(jù)GenBank中登錄的CSFV基因組序列及原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)E2蛋白A/D區(qū)域的原核表達(dá)引物，利用PCR技術(shù)從本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-TE2中擴(kuò)增出大小為290bp的基因E（A），為了獲得E（A）

3、蛋白作為制備單抗的抗原，我們應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將E（A）基因亞克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta。經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒PCR與雙酶切鑒定后，篩選獲得陽(yáng)性克隆pGEX-4T-E（A）。然后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)對(duì)含有pGEX-4T-E（A）質(zhì)粒的Rosetta菌進(jìn)行了大量表達(dá)，獲得了較高濃度的GST-E（A）包涵體蛋白，用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解，提取了大量的可溶性GST-E（A）融合蛋白。

4、融合蛋白的分子量約為35.0KD，與預(yù)期結(jié)果相符。Folin-酚法測(cè)定提取蛋白的濃度為2.14mg/ml，滿足下一步實(shí)驗(yàn)的要求。
　　 其次，利用純化的GST-E（A）融合蛋白免疫BABL/c小鼠，制備鼠抗豬瘟病毒E2蛋白的單克隆抗體。取三次免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按10：1進(jìn)行融合，10～15天后初次檢測(cè)。試驗(yàn)中共融合兩次，兩次融合率分別約為80％和70％，初檢陽(yáng)性率分別為10％和5％。經(jīng)多次亞克隆反復(fù)篩選后，

5、共獲得兩株可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為C3和A1。雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)后，仍能分泌高效價(jià)的抗體。C3和A1的雜交瘤細(xì)胞上清和小鼠腹水ELISA效價(jià)分別為1：2000、1：2000和1：256000、1：128000左右。Western-blot和IFA分析表明，兩株單抗均可以識(shí)別CSFV兔化弱毒疫苗株，同時(shí)也與GST-E（A）融合蛋白發(fā)生特異性的反應(yīng)，說(shuō)明該單抗是針對(duì)豬瘟病毒E2蛋白上的一個(gè)保守線性表位。

6、　　 最后，為了研究CSFV E2蛋白抗原表位的性質(zhì)，對(duì)單抗C3的抗原表位進(jìn)行了初步篩選，應(yīng)用DNAStar分析軟件對(duì)E（A）基因的原表位進(jìn)行分析，分段表達(dá)各抗原表位的融合蛋白GST-E（A1）和GST-E（A2），利用Western-blot分析，結(jié)果顯示，單抗C3識(shí)別的抗原表位位于序列TAVSPTTLRT之間，該結(jié)果需利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)。
　　 綜上所述，本研究構(gòu)建了E2原核表達(dá)的重組質(zhì)粒，成功制備了兩株針對(duì)CS