豬瘟病毒E2基因的克隆及其在昆蟲細胞中的表達.pdf

1、該文利用反轉錄PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)技術,對流行于國內部分地區(qū)的9株豬瘟病毒(CSFV)E2基因進行克隆,并對其核苷酸及氨基酸序列的同源性進行比較及分析,繪制了系統(tǒng)關系發(fā)生樹,以期了解近期豬瘟流行野毒主要保護性抗原E2基因的變異情況,為豬瘟的防制提供分子流行病學方面的資料.同時以1株(陜西周至株)為材料,在昆蟲細胞中進行表達,為新型豬瘟基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎.(1)采用RT-PCR和nPCR擴增出9株

2、國內近期豬瘟流行野毒株的E2基因,將其分別克隆于pMD18-T載體并進行核苷酸序列測定,根據C-株,Brescia株,Alfort株及Shime株確定起始氨基酸三聯(lián)體的正確位置后進行氨基酸序列推導,并進行了同源性比較,繪制了系統(tǒng)關系發(fā)生樹.結果表明,所測9株CSFV E2基因的長度均為1324 bp,編碼的氨基酸序列均包括完整信號肽序列和跨膜序列,共由442個氨基酸殘基組成.可將13株(包括4株參考毒株)CSFV分為兩個組群,GXGL,

3、GXNN,LNAS,SDJN 4株毒株與C株,Shimen株,Alfort株和Brescia株同為一個群組,其E2基因間的核苷酸序列同源性為94.0%~99.4%,所推導氨基酸序列同源性為93.7%~99.5%.HNLS,SXZZ,HNCA,HNXY和HNDX 5株同為另一群組,之間核苷酸序列同源性為81.9%~99.7%,所推導氨基酸序列同源性為88.2%~99.1%.13株E2基因間的核苷酸序列同源性為81.9%~99.7%,所推導

4、氨基酸序列同源性為88.2%~99.5%,其中9株流行野毒與4株參考毒株之間核苷酸序列同源性為81.9%~98.9%,所推導氨基酸序列同源性為88.2%~99.5%.說明近期流行毒株的變異呈現(xiàn)一定的多樣性.通過對主要抗原區(qū)域氨基酸位點變異進行分析,發(fā)現(xiàn)各毒株間抗原決定簇未發(fā)生明顯的變異.(2)對已知的E2基因進行分析后,用聚合酶鏈式反應(PCR)從陜西周至株克隆化E2全基因中擴增出除去3′端跨膜區(qū)的特異性片段(1 033 bp),并在其

5、兩端引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點,將其亞克隆到桿狀病毒轉移載體pFastBacHTb,獲得重組質粒pFBHT-E2,轉化進含穿梭載體Bacmid的感受態(tài)細胞DH10Bac,得到含E2基因的重組載體質粒rBacmid-E2,以脂質體介導的方法將此重組載體質粒轉染sf9昆蟲細胞,經SDS-PAGE和Western-blotting及ELASA等方法檢測,結果表明,此E2基因在昆蟲細胞中正確表達,表達的蛋白能與豬瘟陽性血清發(fā)生特異性