牛MSCs生物學特性及體外誘導(dǎo)分化為心肌細胞的研究.pdf

1、[目的]建立牛骨髓間充質(zhì)干細胞(marrowmesenchymalstemcells，MSCs)分離培養(yǎng)體系，研究牛MSCs的生物學特性，并根據(jù)其生物學特性及體外誘導(dǎo)分化潛能對其進行鑒定;探討牛MSCs體外定向誘導(dǎo)分化為心肌細胞，對誘導(dǎo)分化的心肌細胞進行特異性標志基因的分子生物學檢測，為轉(zhuǎn)基因良種肉牛培育提供種子細胞，提高轉(zhuǎn)基因的效率。
　　 [方法]
　　 1、通過貼壁篩選法分離培養(yǎng)牛MSCs，觀察其生長特性。

2、　　 2、利用染色、核型分析以及繪制生長曲線和計算貼壁率的方法對純化后，可以穩(wěn)定傳代的牛MSCs生物學特性進行了鑒定;在體外成功的定向誘導(dǎo)牛MSCs分化為脂肪樣細胞和成骨樣細胞，并對誘導(dǎo)出現(xiàn)的脂肪樣細胞和成骨樣細胞分別用油紅O染色鑒定和VonKossa染色鑒定。
　　 3、利用獲取純化穩(wěn)定的P4、P8、P12代牛MSCs經(jīng)5umol/L、10umol/L、15umol/L三種濃度的5-氮雜胞苷(5-Aza)進行體外誘導(dǎo)分化，經(jīng)

3、3周誘導(dǎo)后，隨機取10個非重疊視野(×200)，統(tǒng)計并計算心肌細胞的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果用均數(shù)±標準差表示。并對誘導(dǎo)出現(xiàn)的心肌樣細胞進行形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定。
　　 [結(jié)果]獲得了高純度且增殖能力較強的牛MSCs，并在體外成功誘導(dǎo)其分化為脂肪樣細胞和成骨樣細胞，并且染色體核型分析正常，利用5-Aza誘導(dǎo)后的細胞大多呈現(xiàn)長梭形，排列方向一致，有肌管樣結(jié)構(gòu)形成。相同代數(shù)的牛MSCs在10umol/L的5-Aza作用下誘導(dǎo)效果最佳;在相

4、同濃度的5-Aza作用下，牛MSCs向心肌細胞的轉(zhuǎn)化率隨著傳代次數(shù)的增加逐漸降低。P4代牛MSCs在10umol/L的5-Aza經(jīng)3周的作用下，誘導(dǎo)分化率最高，達到48.6％.。RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化后的細胞明顯表達心肌細胞的四種特異性標志基因，分別是α-心臟肌動蛋白(378bp)，結(jié)蛋白(601bp)，心臟肌鈣蛋白T(331bp)，β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）(273bp)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、本試驗從

5、牛骨髓中分離培養(yǎng)的這種成纖維貼壁細胞在特定的誘導(dǎo)條件下能夠在體外分化為脂肪樣和成骨樣細胞，表明其具有多項分化潛能，根據(jù)細胞可以穩(wěn)定傳代保持未分化狀態(tài)及染色后的形態(tài)學特征和染色體核型分析，證明這種細胞具有骨髓間充質(zhì)干細胞基本生物學特征。
　　 2、牛MSCs體外經(jīng)5-氮雜胞苷3周定向誘導(dǎo)能分化為心肌細胞，對誘導(dǎo)分化后的細胞進行分子生物學鑒定，表達出了心肌細胞四種特異性標志基因，分別是α-心臟肌動蛋白(378bp)，結(jié)蛋白(601b