AS、GS和PNS誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細胞的研究.pdf

1、心肌梗死后存活的心肌減少、繼發(fā)心室重構(gòu)，是造成心肌梗死患者發(fā)生心力衰竭、心律失常甚至死亡的重要原因，由于心肌細胞不能再生，損害的心肌細胞不能修復(fù)和分化，因此臨床中藥或西藥治療、介入治療和手術(shù)治療均不能代替壞死的心肌，而心臟移植由于手術(shù)復(fù)雜、供體困難和費用高等原因，在臨床很難推廣。因此，尋找可代替死亡細胞的移植物來防治心肌梗死后心衰、心肌重構(gòu)，改善心功能是近年來研究的重要課題。近年的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓基質(zhì)中還存在另一類干細胞稱之為骨髓間充質(zhì)干

2、細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，在一定的環(huán)境和刺激因子作用下可分化為多種組織細胞，在組織工程中，MSCs作為一種重要的種子細胞越來越引起人們的關(guān)注，將MSCs誘導(dǎo)分化為心肌細胞移植治療心肌梗死，為中藥與干細胞結(jié)合治療心血管疾病提供新的理論依據(jù)。 1、理論研究 MSCs屬于非造血細胞，其基本特點是貼壁生長，呈紡錘狀的纖維細胞樣形態(tài)，國內(nèi)外研究認為MSCs具有獨特的表征和巨大的培養(yǎng)增殖能力，并且認

3、為MSCs是多向分化潛能的干細胞，在一定條件下可以分化為骨骼、軟骨、肌肉、神經(jīng)和造血微環(huán)境組織等，具有很高的可塑性。國內(nèi)外學(xué)者在體外培養(yǎng)中將MSCs經(jīng)細胞傳代后用5-氮胞苷(5-azacytidine，5-aza)對其進行誘導(dǎo)分化，可見有心肌細胞樣超微結(jié)構(gòu)，有心肌特異性基因表達，并有持續(xù)的動作電位，表明他們成功地誘導(dǎo)出心肌細胞。另有學(xué)者將MSCs直接注入自體心肌組織內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有心肌樣細胞形成，具有肌鈣蛋白T和肌球蛋白重鏈染色陽性的心肌細胞

4、特異性標(biāo)志，表明MSCs在體內(nèi)微環(huán)境條件下可以誘導(dǎo)分化為心肌細胞 近年來，有研究證明中藥能有效地誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元細胞和成骨細胞，并且誘導(dǎo)率高。 由于MSCs的可塑性大，在某種條件下可以分化為包括心肌細胞在內(nèi)的多種功能細胞，而應(yīng)用中藥成功誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)元樣細胞和成骨細胞的研究結(jié)果提示我們，在理論上可以相信某些中藥有可能誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細胞。 目前國內(nèi)外對中藥能否誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細胞的研究

5、還報道甚少，所以我們在眾多的中藥中，篩選臨床上常用治療冠心病的藥物，如黃芪、人參、三七的有效成分來進行研究，黃芪甲苷(AS)、人參總皂甙(GS)、三七總皂甙(PNP)分別是它們的有效成分，現(xiàn)代中藥藥理研究表明，它們都具有促進骨髓干細胞的增殖和分化、抗心肌缺血和預(yù)防心肌再灌注損傷等作用。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對MSCs誘導(dǎo)分化為心肌細胞的研究雖取得了一定的進展，但是單純的MSCs進行在體移植，具有很多局限；而用5-aza體外誘導(dǎo)MSCs，其心

6、肌細胞的分化率不高，其安全性和有效性還難以實現(xiàn)。因此有必要再次遴選對MSCs誘導(dǎo)分化率高，且臨床安全性和有效性好的藥物。 研究探索某些中藥誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細胞，不僅將為應(yīng)用中醫(yī)藥治療心肌梗死提供新的理論依據(jù)，而且可以克服目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中存在的某些困境，因此有可能與細胞移植的方法相結(jié)合治療缺血性心臟病，可作為現(xiàn)代治療方法的補充手段。所以積極開展中藥誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細胞的研究并與干細胞移植結(jié)合起來有可能是中醫(yī)藥走向現(xiàn)代

7、化的一個切入點，具有重大的實際意義。本研究將選用中藥有效成分、單體(AS、GS和PNS)對大鼠MSCs進行體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)，觀察誘導(dǎo)后的細胞形態(tài)，用免疫組化和RT-PCR檢測是否有心肌特異性蛋白基因表達，以證實AS、GS和PNS可定向誘導(dǎo)出心肌樣細胞。 2、實驗研究 目的：探討中藥有效成分、單體(AS、GS和PNS)體外誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細胞定向分化為為心肌樣細胞。 方法：純種7周齡SD大鼠，SPF級，雌雄不限，體重1

8、90g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供；通過密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法分離大鼠MSCs，體外擴增、培養(yǎng)、用流式細胞儀鑒定MSCs并連續(xù)傳代至第八代，分組進行體外誘導(dǎo)。分別為AS組(終末濃度為250mg/L)、GS組(終末濃度為250mg/L)、PNS組(終末濃度為250mg/L)、5-aza組(終末濃度為10umol/L)、AS+5-aza組(終末濃度分別為250mg/L、10umol/L)、GS+5-aza組(終末濃度分別為250mg/L

9、、10umol/L)、PNS+5-aza組(終末濃度分別為250mg/L、10umol/L)，根據(jù)誘導(dǎo)時間把上述各組再分3個亞組，分別對MSCs進行24h、48h、72h誘導(dǎo)；并設(shè)空白對照組，僅用基本培養(yǎng)基(IMDM)誘導(dǎo)。 誘導(dǎo)后更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次，并觀察細胞形態(tài)變化，連續(xù)4周，之后進行免疫組化采用SABC試劑盒檢測心肌結(jié)蛋白(Desmin)和心肌特異性肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI)，RT-PCR技術(shù)采用Pr

10、omega—步法試劑盒鑒定α-心肌肌球蛋白重鏈(α-MHC)和β-心肌肌球蛋白陽性表達。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的MSCs，24h后大部分MSCs均已貼壁，3～4d后細胞呈集落生長，其形態(tài)多變化為短梭形，可見核仁。傳代后第3d可見細胞體積較原代細胞增大，大部分呈紡錘狀或纖維狀等多種形態(tài)，胞漿透明，胞核明顯。應(yīng)用FACScan流式細胞儀檢查MSCs表面抗原，CD34表達為陰性CD44表達為陽性。經(jīng)AS、GS、PNS、5-aza等誘導(dǎo)后，細

11、胞形態(tài)從原來的成纖維狀變?yōu)榕帕汹呌谳^為一致的長梭形，且體積增大，4周后，細胞周圍伸出較多長的突起，體積大小不等，呈梭形，有纖維樣結(jié)構(gòu)存在，并出現(xiàn)肌管。免疫組化鑒定：未經(jīng)誘導(dǎo)MSCs的空白對照組中未發(fā)現(xiàn)Desmin、cTnI陽性細胞，已誘導(dǎo)MSCs的藥物實驗組中Desmin免疫組化染色均可見強陽性免疫復(fù)合物，呈集落樣分布，AS組與AS+5-aza組、GS組與GS+5-aza組、PNS組與PNS+5-aza組、5-aza組、的陽性率分別約為

12、35％～36％。而在已誘導(dǎo)MSCs的藥物組中均發(fā)現(xiàn)cTnI陽性細胞，AS組與AS+5-aza組、GS組與GS+5-aza組、PNS組與PNS+5-aza組、5-aza組的陽性率分別約為18％～20％，胞質(zhì)中可見明顯的肌原纖維結(jié)構(gòu)，陽性細胞散在分布，呈梭形和成纖維細胞樣形態(tài)。RT-PCR檢測誘導(dǎo)后的MSCs心肌特異因子的表達：以正常大鼠心肌細胞MHC為陽性條帶為對照，MSCs用AS、GS、PNS、5-aza誘導(dǎo)2周后，MHC開始表達，持續(xù)