TSC1-TSC2復合物失活抑制AKT的機制及其功能研究.pdf

1、目的：結節(jié)性硬化癥（TSC）是由兩種抑癌基因TSC1或TSC2的功能性失活突變導致哺乳動物雷帕霉素靶點復合物1（mTORC1）的活化所引起。而且TSC1/TSC2復合物失活導致的 mTORC1過度活化能夠負反饋抑制 AKT，這被認為是TSC多為良性腫瘤的主要原因之一。然而，這種負反饋調節(jié)的確切機制我們仍然不是很清楚，而我們的研究目的則是進一步闡明這種機制。
　　方法：在前期的研究工作中，我們通過基因芯片分析，發(fā)現與對照小鼠胚胎成纖

2、維細胞（Tsc2+/+MEFs）相比，Tsc2缺失的小鼠胚胎成纖維細胞（Tsc2-/-MEFs）中血小板源性生長因子受體α（PDGFRɑ）的表達明顯下調。蛋白印記（WB）和實時定量PCR（qRT-PCR）進一步證實。并且雷帕霉素（rapamycin）處理或siRaptor干擾能夠恢復Tsc2-/-MEFs中的PDGFRα的表達。接著我們構建PDGFRα過表達的Tsc2-/-MEFs或Tsc1-/-MEFs以及PDGFRα敲低的Tsc2+

3、/+MEFs或Tsc1+/+MEFs，CCK-8法和克隆形成實驗檢測細胞增殖和克隆形成能力。將PDGFRα過表達的Tsc2-/-MEFs及其對照細胞分別皮下注射到裸鼠體內誘導形成腫瘤，接著監(jiān)測腫瘤生長。腫瘤組織進行HE和免疫組織化學染色分析。構建的過表達或敲低PDGFRα的細胞系進行饑餓加血清或PDGF處理，WB檢測蛋白表達情況。收集Tsc2+/+or Tsc1+/+MEFs、Tsc2-/-or Tsc1-/-MEFs以及雷帕霉素處理的

4、Tsc2-/-or Tsc1-/- MEFs進行蛋白印跡實驗，并對Tsc2+/+ MEFs、Tsc2-/- MEFs以及雷帕霉素處理的Tsc2-/-MEFs進行核質蛋白分離分析和激光共聚焦實驗檢測Tsc2缺失以及雷帕霉素處理后FOXO3a表達變化。建立FOXO3a過表達的Tsc2-/- MEFs或Tsc1-/- MEFs和用siFOXO3a干擾敲低FOXO3a表達的Tsc2+/+ MEFs或Tsc1+/+MEFs，WB和qRT-PCR驗

5、證并檢測PDGFRα，p-AKT的表達。在線預測小鼠PDGFRα基因上的FOXO3a結合位點，并對結合位點進行突變，熒光素酶報告基因實驗分析相對熒光素酶活性。雷帕霉素和AG1295（PDGFRα抑制劑）聯(lián)合處理Tsc2-/-MEFs或Tsc1-/-MEFs后檢測細胞增殖情況。NTC/T2缺失細胞皮下注射到裸鼠靠近腋窩的位置來評估體內聯(lián)合使用雷帕霉素和AG1295的效果，監(jiān)測腫瘤體積，重量以及小鼠體重。
　　結果：在這里我們展示了T

6、sc1或Tsc2的缺失下調PDGFRα的表達是由活化的mTORC1介導的。另外，我們還證明了PDGFRα的異位表達促進了AKT的活化，增強了TSC1或TSC2功能性缺失的小鼠胚胎成纖維細胞的增殖和成瘤能力，反之亦然。此外，我們發(fā)現mTORC1是FOXO3a的負調控因子，并且活化的mTORC1是通過FOXO3a介導的PDGFRα基因轉錄下調抑制PDGFRα的表達。有趣的是，我們通過實驗還發(fā)現在體內和體外聯(lián)合使用雷帕霉素與AG1295都能明

7、顯抑制TSC1/TSC2復合物缺陷細胞的生長。
　　結論：因此，我們得出TSC1/TSC2-mTORC1信號通路通過抑制FOXO3a負調控PDGFRɑ的表達，PDGFRɑ的表達下調抑制了AKT激活和限制了TSC腫瘤的發(fā)生發(fā)展。表明FOXO3a/PDGFRα/AKT信號通路在抵抗TSC1/TSC2復合物缺失引起mTORC1的過度活化從而誘導腫瘤發(fā)生中起保護作用。并且聯(lián)合使用雷帕霉素和AG1295可能是TSC治療的一個新的有效的策略。