梅毒螺旋體實驗室檢驗

1、灌南縣第一人民醫(yī)院檢驗科金建懷2016年6月17日,梅毒的實驗室診斷,概述,梅毒及其病原學特征梅毒流行狀況梅毒實驗室診斷暗視野顯微鏡檢查及臨床意義梅毒血清學檢查及臨床意義梅毒檢測試劑評估梅毒診斷標準知識要點與報告要求,梅毒及其病原學特征,梅毒 syphilis,梅毒（syphilis）是由梅毒螺旋體（treponema pallidum）引起的主要通過性接觸或血液傳播，侵犯多系統(tǒng)多臟器的全身性慢性傳染病。臨床癥狀

2、復雜,時隱時現(xiàn)傳染途徑:性傳播,垂直傳播,其它途徑,梅毒螺旋體特征,有6～12個規(guī)則的螺旋螺旋整齊，數(shù)目固定折光性強，較其他螺旋體亮運動緩慢而有規(guī)律，有三種運動方式圍繞其長軸旋轉(zhuǎn)運動伸縮其螺旋間距離移動彎曲扭動如蛇行,暗視野梅毒螺旋體,梅毒螺旋體,熒光法檢查梅毒螺旋體,梅毒螺旋體特征,人是梅毒螺旋體的唯一自然宿主梅毒螺旋體不能在體外培養(yǎng)繁殖最適生存溫度是37℃，離開人體很快死亡 ● 梅毒螺旋體屬厭氧微生物，耐寒能

3、力強。煮沸、干燥、肥皂水及一般消毒劑均可短期內(nèi)將其殺死,梅毒螺旋體致病性,致病物質(zhì)：莢膜樣物質(zhì)、粘多糖酶所致疾病——梅毒后天梅毒－－經(jīng)性接觸傳染 臨床分期 一期梅毒：外生殖器硬性下疳 二期梅毒：全身梅毒疹 三期梅毒：皮膚粘膜潰瘍、侵犯內(nèi)臟器官或組織 隱性梅毒：無任何梅毒性的癥狀和體征先天梅毒－－經(jīng)胎盤傳給胎兒 胎兒表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎 出生后表現(xiàn)為鋸齒形牙、鞍形鼻等,2

4、010年全國梅毒疫情地區(qū)分布,發(fā)病率位于前5位：浙江：97.13/10萬廣西：82.58/10萬上海：75.93/10萬福建：58.23/10萬新疆：52.97/10萬,2010年全國梅毒疫情年齡與性別分布,男女性別比：0.94︰115-39歲：女性多于男性40歲以上：男性多于女性,,標本采集部位：皮膚或粘膜損害 有痂者去痂，先用無菌棉球或紗布蘸生理鹽水，將皮損拭凈，輕壓皮損至滲液（避免出血）。然后用載玻片印取滲液，

5、立即檢查，未破潰者用手術(shù)刀刮破皮疹，取滲出液。淋巴結(jié)穿刺液 以無菌操作法用注射器吸取0.25-0.5ml生理鹽水，穿刺入淋巴結(jié)，再回吸2～3次，最后將吸取液涂玻片上，立即檢查。,梅毒暗視野采樣,,,暗視野顯微鏡檢查,制片 標本置于載玻片上，加一滴生理鹽水，蓋上蓋玻片，在暗室中于暗視野顯微鏡上油鏡觀察觀察先用低倍鏡，再轉(zhuǎn)至高倍鏡梅毒螺旋體在暗背景上呈白色發(fā)光，螺旋整齊，運動規(guī)律（旋轉(zhuǎn)、伸縮或蛇行運動）,暗視野顯微鏡檢查,結(jié)

6、果解釋—陽性暗視野顯微鏡查陽性，臨床上可確診梅毒特別對一期梅毒硬下疳，腫大淋巴結(jié)，二期梅毒皮膚粘膜損害的診斷有重要價值，尤其使用于早期梅毒血清學陰性時,暗視野顯微鏡檢查,結(jié)果解釋—陰性陰性結(jié)果不能排除梅毒螺旋體數(shù)量不足已用過抗生素或某些外用藥 損害接近自然消退損害不是梅毒檢驗人員技術(shù),暗視野顯微鏡檢查,特點該方法具有快速、方便、可靠的特點，已被WHO確定為性病實驗室必備項目之一口腔中含有其他密螺旋體，與梅毒螺旋體

7、不易區(qū)別，暗視野顯微鏡查不推薦于口腔皮損材料,梅毒血清學檢查,血清學方法是診斷各期梅毒的主要方法，包括：非特異性血清學試驗（非梅毒螺旋體抗原血清試驗） 用于初篩試驗、療效觀察。特異性血清學試驗（梅毒螺旋體抗原血清試驗） 用于確證試驗，對療效觀察意義不大。局限性：非常早期的梅毒可能出現(xiàn)陰性，還需做病原體檢查。,國內(nèi)梅毒血清學試驗的傳統(tǒng)程序是：先以非梅毒螺旋體抗原血清試驗（如RPR、TRUST、VDRL等）進行初篩，再以梅

8、毒螺旋體抗原血清試驗（如TPPA、TPHA、FTA-ABS等）進行確認。美國、法國和比利時也采用類似的程序。該程序的優(yōu)點是排除了大多數(shù)感染過梅毒但經(jīng)過充分治療的病人，從而使臨床更易決定是否需要進行抗梅治療。,將梅毒螺旋體抗原血清試驗和非梅毒螺旋體抗原血清試驗組合在一起（如RPR+TPHA或TPPA）作為初篩試驗可以最大限度地檢出各期梅毒病例（除一期梅毒的極早期），同時保證了敏感性和特異性，是最為理想的梅毒初篩方案。這是世界衛(wèi)生組織

9、（WHO）推薦的方案，英國等一些歐洲國家也已采用多年。其缺點是費時費力，實驗室的工作量較大。,梅毒的確認必須采用特異性梅毒螺旋體抗原血清試驗，最常用的是TPPA或TPHA，也可采用ELISA。FTA-ABS仍被認為是梅毒血清學測定的“金標準”，但使用上有很大限制。多數(shù)實驗室無法常規(guī)開展，因此一般只用于對有爭議標本的檢測。如果僅使用非梅毒螺旋體抗原血清試驗進行初篩，則可以用任意一種梅毒螺旋體抗原血清試驗做確認；如果在初篩時已使用了梅毒

10、螺旋體抗原血清試驗，則可以考慮選用另一方法學的梅毒螺旋體抗原血清試驗進行確認（例如在初篩時使用了TPPA或TPHA，則可用ELISA進行確認，反之亦然）。,非梅毒螺旋體抗原血清試驗,本法主要檢測抗梅毒螺旋體細胞膜上脂類的IgG和IgM抗體。 原理：人體感染梅毒螺旋體后，組織破壞所釋放的類脂，與梅毒螺旋體結(jié)合后形成完全抗原，刺激機體產(chǎn)生類脂質(zhì)抗體（反應素）。主要為IgG，IgM的混合抗體,非梅毒螺旋體抗原血清試驗,已知抗原：心磷脂、卵

11、磷脂及膽固醇檢測成分：血清梅毒反應素方法：性病研究實驗室玻片試驗（VDRL）血清不需加熱的反應素玻片試驗（USR）快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗（RPR）甲苯胺紅血清不需加熱試驗（TRUST）,RPR/TRUST,原理:RPR:以黑色的炭顆粒作為指示標記物TRUST:以紅色的甲苯胺紅顆粒作為指示標記物檢測成分：血清梅毒反應素,,,,,,RPR/TRUST,定性試驗在紙卡圓圈中加入50μL待檢血清，涂滿整個圓圈使用滴管和

12、專用針頭，加1滴混勻的抗原懸液旋轉(zhuǎn)100rpm，8min立即判斷結(jié)果,,,RPR/TRUST,結(jié)果判斷陽性：在圓圈中見不規(guī)則大小黑色/紅色凝集塊陰性：在圓圈中無黑色/紅色凝集塊，僅見黑色/紅色顆粒集于中央一點或均勻分散。,非梅毒螺旋體抗原血清試驗的優(yōu)缺點：優(yōu)點： *敏感性特異性好 *不需要昂貴設備，簡單易行 *適用于大量人群的血清篩查 *有效治療后血清滴度可下降

13、并陰轉(zhuǎn)，故可作療效觀察、判愈、復發(fā)。 *20分鐘可獲得實驗結(jié)果。 *試劑與方法均已標化，各實驗室間結(jié)果可比較。 *試驗可被內(nèi)部質(zhì)控和外部質(zhì)控監(jiān)控進行。缺點： *敏感性和特異性低于螺旋體抗原試驗，BFP反應和前帶現(xiàn)象,,渾濁,（定性）,RPR/TRUST,定量試驗待檢血清用等滲鹽水在紙卡圓圈中作梯度稀釋：原血清，1:2，1:4，1:8，1:16，1:3

14、2……按定性試驗步驟操作，以出現(xiàn)陽性反應的最高稀釋度報告結(jié)果,,,,（倍比稀釋）,RPR/TRUST,注意事項：實驗環(huán)境溫度應為：23-29 ℃抗原應保存于4 ℃冰箱，實驗前應恢復到室溫。抗原應防止凍結(jié)。血液標本實驗前應恢復到室溫，并在24小時內(nèi)完成檢測。試驗完畢應立即觀察結(jié)果。,RPR/TRUST,假陰性有25%-40%的未治療梅毒在晚期隱性期可自然逆轉(zhuǎn)為陰性，約30%的心血管和神經(jīng)梅毒呈陰性前帶現(xiàn)象：抗原抗體量比例不

15、適，抑制陽性反應。一般易發(fā)生在滴度在1：500以上的標本中。 1%的II期梅毒會出現(xiàn)前帶現(xiàn)象操作人員應注意實驗的溫度，試劑盒從冰箱取出后應恢復至室溫，室溫過低（〈10℃）可能出現(xiàn)假陰性或結(jié)果不準確（即使出陽性結(jié)果，試驗滴度也不準）。,RPR/TRUST,生物學假陽性：急性或慢性傳染?。猴L疹、麻疹、水痘、瘧疾、上呼吸道感染、病毒性肝炎，活動性肺結(jié)核、麻風，肺炎球菌性肺炎等；②其它疾?。篠LE、類風濕性關(guān)節(jié)炎、風心病、DLE、肝硬化、

16、慢性腎炎、系統(tǒng)性硬化癥、自身免疫性溶血性貧血等；③身體狀況改變：麻醉劑成癮、妊娠、年老等一般假陽性血清抗體滴度<1：8應排除技術(shù)性、生理性和生物學假陽性，并用特異性試驗來證實,梅毒螺旋體抗原血清試驗,已知抗原：梅毒螺旋體抗原檢測成分：抗梅毒螺旋體抗體方法： 1.熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS） 2.梅毒螺旋體血球凝集試驗（TPHA） 3.梅毒螺旋體顆粒凝集試驗（TPPA） 4.梅毒

17、螺旋體ELISA試驗 5.快速試驗（膠體金）,TPPA,原理：用整菌和其片斷做抗原致敏的明膠顆粒，此致敏顆粒與人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應敏感性和特異性均高敏感性：一期梅毒：70%-100%， 二期梅毒：100% 三期梅毒95%-98%特異性：94%-100%容許做梅毒的精確診斷,TPPA,原理示意圖,,明膠顆粒,,抗原,TPPA,材料U型板 、微量

18、加樣器（25ul）、振蕩器TPPA試劑盒(溶解液，樣本稀釋液, 致敏顆粒, 非致敏顆粒,質(zhì)控血清,專用滴管）,方法,TPPA,結(jié)果判斷陰性(－):顆粒沉積在孔底,周邊平滑,或形成致密圓圈 可疑反應(±):明膠顆粒沉積在孔底,中央形成致密小環(huán), 周邊平滑陽性(+/++):內(nèi)有清晰的寬環(huán)且外緣粗糙強陽性(+++/ ++++):孔內(nèi)凝聚顆粒形成均一的膜覆蓋在整

19、 個孔底者孔內(nèi)樣品與致敏和非致敏顆粒均產(chǎn)生凝集者,則需作重吸收試驗后進一步檢測,,,,TPPA,,TPPA,,TPPA,注意事項①專用滴管應標明不能混用，不能用來稀釋血清。②未致敏孔不發(fā)生凝集，否則試驗無效。如果標本與非致敏和致敏顆粒均產(chǎn)生凝集，需作重吸收試驗。③反應板要清潔干凈，孔內(nèi)無異物。④試劑保存于2~10℃，不可凍結(jié)，不同批號試劑間不可混用,其它常用確證方法,梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELIS

20、A）快速檢測試劑（膠體金）,梅毒血清學檢查臨床意義,非特異性血清學試驗陽性可能表示：現(xiàn)癥感染、接受或未接受過治療的近期感染可用于療效觀察、判愈、判定復發(fā)及再感染 早期梅毒患者經(jīng)充分治療后，滴度逐漸下降，半年到2年大部分非特異性血清學試驗陰轉(zhuǎn)可能有生物學假陽性(滴度常<1:8）適用于人群篩查、產(chǎn)前檢查及健康體檢,梅毒血清學檢查臨床意義,特異性血清學試驗陽性結(jié)果表示現(xiàn)癥感染接受或末接受過治療的近期感染既往曾經(jīng)感染

21、特異性血清學試驗因其敏感性高，特異性強，可作為證實試驗及排除假陽性。特別是隱性梅毒及一些非梅毒螺旋體抗原血清試驗陰性而又懷疑為梅毒的患者。在多數(shù)情況下，一旦感染了梅毒，特異性血清學試驗抗體陽性可保持數(shù)年，甚至終生陽性，故定性的特異性血清學試驗不能用于觀察療效、判斷復發(fā)及再感染。,梅毒血清學檢查臨床意義,梅毒感染的較早期，機體尚未產(chǎn)生抗體，非特異性血清學試驗和特異性血清學試驗均可陰性，需追蹤觀察。,試驗結(jié)果RPR+,TPPA-RPR

22、+,TPPA+RPR-, TPPA+RPR-, TPPA-,RPR假陽性,現(xiàn)癥梅毒，治愈的晚期梅毒,極早期梅毒，治愈的早期梅毒,排除梅毒感染,意義,極早期梅毒（尚無任何抗梅毒抗體產(chǎn)生）,常見結(jié)果分析,常見結(jié)果分析,常見結(jié)果分析,檢測策略,檢測策略,梅毒檢測試劑評估結(jié)果,梅毒螺旋體抗體檢測試劑評估結(jié)果,非梅毒螺旋體抗體檢測試劑評估結(jié)果,梅毒診斷標準知識要點,梅毒診斷標準,梅毒診斷標準根據(jù)衛(wèi)生部衛(wèi)生行業(yè)標準《梅毒診斷標準》(WS273－

23、2007)。梅毒診斷分為一期、二期、三期、隱性和胎傳梅毒。梅毒診斷原則應根據(jù)流行病學史、臨床表現(xiàn)及實驗室檢查等進行綜合分析。,梅毒診斷標準,,梅毒經(jīng)充分治療后，應隨訪2－3年。第一年每3個月復查一次，以后每半年復查一次，包括臨床和血清（非螺旋體抗原試驗）。如在治療后6個月內(nèi)血清滴度未有4倍（即2個稀釋度）下降，應視為治療失敗，或再感染，除需加倍重新治療外，還應考慮是否需要作腦脊液檢查，以觀察神經(jīng)系統(tǒng)有無梅毒感染。一期梅毒在1年以內(nèi)、二期