梅毒的實驗室檢查概述

1、梅毒的實驗室檢查,,梅毒的定義,梅毒是一種慢性傳染性疾病。是由梅毒螺旋體（蒼白螺旋體）引起，患病后病程漫長，早期侵犯生殖器和皮膚， 晚期侵犯全身各器官，并生多種多樣的癥狀和體征，病變幾乎能累及全身各個臟器。,病原體,為梅毒螺旋體，屬于密螺旋體屬，蒼白密螺旋體蒼白亞種(Treponema pallidum subspecies pallidum) 蒼白亞

2、種 梅毒 蒼白螺旋體 地方亞種 地方性梅毒 極細亞種 雅司病密螺旋體屬 品他螺旋體 品他病,,,,梅毒螺旋體的生物學(xué)特性,1、直徑

3、 0.10~0.15μm，有8~14個致密而規(guī)則的 小螺旋，兩端尖直。2、原生質(zhì)圓柱體上緊繞著3~4根周漿鞭毛，故運 動活躍，運動方式多樣。3、G-，但不易著色。Fantana鍍銀染色呈棕褐色。4、在無活細胞的人工培養(yǎng)基中難培養(yǎng)，生長慢。5、抵抗力極弱，對溫度和干燥特別敏感；對青霉 素、四環(huán)素、紅霉素等抗生素敏感。在干燥條件下不易生存。肥皂水和一般消毒劑以及加溫42℃以上均極易將其殺滅。,

4、傳播途徑,性接觸是主要的傳染途徑 未經(jīng)治療的患者在感染后的1年內(nèi)最具有傳染性 隨著病期的延長，傳染性越來越小 到感染后2年，通過性接觸一般無傳染性母嬰傳播 在妊娠7周時，梅毒螺旋體即可通過胎盤傳染未經(jīng)治療者，雖已無性傳播（病期>2年），但妊娠時仍可傳染給胎兒病期越長，傳染性越小;輸血傳染間接傳播：日常用品、接吻、哺乳、醫(yī)療器械等途徑（接觸部位附有梅毒螺旋體） 。,免疫性,特異性抗體感染2周后產(chǎn)生特異性IgM抗體,

5、 不能通過胎盤感染4周后出現(xiàn)特異性IgG抗體,可通過胎盤非特異性抗體刺激機體產(chǎn)生抗心磷脂抗體/反應(yīng)素RPR 和 TRUST等方法可檢出：5～7周或硬下疳后2～3周完全治愈的早期梅毒可再感染,梅毒的分期,梅毒的診斷,梅毒的診斷早期梅毒（一期、二期和早期隱性梅毒）和晚期梅毒（三期和晚期隱性梅毒）必須依靠病史、癥狀及實驗檢查進行綜合分析 梅毒的實驗室檢查結(jié)果對診斷有決定性意義,常用梅毒實驗室檢測方法,病原學(xué)檢測法：

6、 （1） 暗視野顯微鏡檢查 （2） 鍍銀染色檢查血清學(xué)檢測法： 非梅毒螺旋體抗原血清試驗 （1）VDRL(性病研究實驗室試驗)：需滅活 （2）USR（不加熱血清反應(yīng)素試驗） （3）RPR(加速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗) （4）TRUS

7、T(甲苯胺紅不加熱血清試驗) 梅毒螺旋體抗原血清試驗 （1）FTA-ABS （2）TPPA/ TPHA （3）TP-ELISA （4）發(fā)光法 （5）膠體金法,暗視野顯微鏡檢查,標本類型：梅毒硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損的滲出液、淋巴結(jié)穿刺液方法：暗視野顯微鏡下查找梅毒螺旋體。結(jié)果：典型

8、的梅毒螺旋體呈白色發(fā)光, 其螺旋較密而均勻。運動方式： ①伸縮其螺旋間距離而移動（主要方式）②蛇行式③旋轉(zhuǎn)式評價：①. 簡單、可靠。②. 早期：硬下疳（梅毒血清學(xué)試驗仍陰性）。③. 陰性不能排出患梅毒的可能性,暗視野顯微鏡下的梅毒螺旋體,鍍銀染色檢查,基本原理：梅毒螺旋體具有親銀性，可被銀溶液染色，從而可以在鏡下觀察到梅毒螺旋體結(jié)果：棕褐色的梅毒螺旋體,病原學(xué)檢查的臨床意義,病原學(xué)方法直接鏡檢到梅毒螺旋體，在臨床可確診梅毒，

9、且具有快速、方便、易操作的特點。 螺旋體檢查是診斷早期現(xiàn)癥梅毒的最佳方法，對于患者的早期診斷、及時治療、預(yù)后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。 如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗,原理（抗心磷脂抗體）：人體感染了梅毒螺旋體后，組織受到破壞，釋放出來的一種類脂成分，與梅毒螺旋體結(jié)合形成完全抗原，刺激機體產(chǎn)生類脂質(zhì)抗體（反應(yīng)素）。主要是IgM和IgG混合抗體?？贵w產(chǎn)生時間 感染3周-4周

10、，硬下疳出現(xiàn)1周-2周一般在感染后5～7周（或硬下疳出現(xiàn)后2～3周）產(chǎn)生。 抗體作用無保護作用，治療監(jiān)測。未經(jīng)治療的病人，其血清內(nèi)的反應(yīng)素可長期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，反應(yīng)素可以逐漸減少至轉(zhuǎn)為陰性。,梅毒自動旋轉(zhuǎn)儀,四種非特異性試驗方法比較,檢測流程（定性）,加樣：吸取50μl血清（漿）放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個圈內(nèi)。 加抗原：將抗原輕輕搖勻，用試劑盒提供的針頭加1滴抗原。 反應(yīng)：將卡片置梅毒自動旋轉(zhuǎn)儀8分鐘立即在亮光

11、下觀察結(jié)果。,檢測流程（定量）,稀釋液準備：在圈內(nèi)加入50μl生理鹽水（根據(jù)需要確定稀釋度），勿將鹽水涂開。 加樣：吸取50μl血清(漿)與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布滿整個圈內(nèi)。 重復(fù)定性試驗后兩步。,凝集反應(yīng)強度分級：,3+～4+：圓圈內(nèi)出現(xiàn)中到大的紅色絮狀物，液體清亮。2+：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小到大的紅色絮狀物，液體較清亮。1+：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小的紅色絮狀物，液體渾濁?！簣A圈內(nèi)僅見紅色集中于中央一點或均勻分散。,RPR定量試驗

12、,中等至大的凝塊為陽性（圈4和7）有明確但很小的凝塊為弱陽性（圈2和3）顆粒均勻分布（圈1,5,8-10）或稍粗糙（圈6）為陰性,,,臨床意義,早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后3個月，VDRL試驗抗體滴度下降2個稀釋度，6個月下降4個稀釋度。 一期梅毒1年后轉(zhuǎn)為陰性 二期梅毒2年后轉(zhuǎn)為陰性。 晚期梅毒治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應(yīng)仍為陽性早期梅毒硬下疳出現(xiàn)1周-2周后，血清可呈陽性。經(jīng)治療后血清

13、滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復(fù)發(fā)或再感染的指征。,假陽性問題,假陽性：非梅毒患者的血清反應(yīng)呈陽性①技術(shù)性假陽性由于標本的保存不當(dāng)（如細胞污染或溶血）、試劑質(zhì)量差或過期、或?qū)嶒炇也僮麇e誤所造成。②生物學(xué)假陽性是由于患者有其他疾病或生理狀態(tài)發(fā)生變化，使梅毒血清試驗出現(xiàn)陽性,急性生物學(xué)假陽性反應(yīng)的疾病,風(fēng)疹水痘傳染性單核細胞增多癥傳染性肝炎上呼吸道感染肺炎球菌性肺炎病毒性肺炎牛痘疹,慢性生物學(xué)假陽性反應(yīng)的疾

14、病,系統(tǒng)性紅斑狼瘡 自身免疫性溶血性貧血盤狀紅斑狼瘡 結(jié)節(jié)性多動脈炎 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 橋本氏甲狀腺炎,風(fēng)濕性心臟病干燥綜合征毒品癮者 慢性腎炎肝硬化老年 麻風(fēng) (是唯一產(chǎn)生慢性生物學(xué)假陽性的感染性 疾病),妊娠的假陽性反應(yīng),這是一種生理情況下的生物學(xué)假陽性 假陽性發(fā)生率較低有報告為0.4%，滴度低。,假陽性問題,梅

15、毒假陽性反應(yīng)的處理 技術(shù)性假陽性反應(yīng)一般是由于操作錯誤引起的假陽性反應(yīng)，經(jīng)過重復(fù)試驗即可除外。 對急性生物學(xué)假陽性反應(yīng)，應(yīng)做TPHA（TPPA）等試驗進行排除。,前帶現(xiàn)象,原理指二期梅毒患者非梅毒螺旋體抗原血清試驗中，有時血清中存在高濃度的抗體時出現(xiàn)的弱陽性、不典型或陰性反應(yīng)的結(jié)果。處理將血清稀釋后再進行試驗。,血清固定,耐血清性（血清固定）指經(jīng)抗梅毒治療后，非梅毒螺旋體抗原血清試驗在一定時期內(nèi)不陰轉(zhuǎn)。早期的耐血清性常與治

16、療量不足或不規(guī)則治療、復(fù)發(fā)、再感染或有神經(jīng)系統(tǒng)梅毒等因素有關(guān)。,梅毒螺旋體抗體血清學(xué)試驗：,檢測血中特異性抗梅毒螺旋體特異蛋白為抗原的抗體（ IgG 和IgM ）。特異性IgM型抗梅毒螺旋體抗體，感染2周后即可測出。,實驗方法,梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA) 梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA) 梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（TP-ELISA） 梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測(RT) 熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS） 化學(xué)發(fā)

17、光免疫分析法（CLIA） 梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（WB）,TPPA/TPHA原理,TPPA試驗原理與TPHA試驗基本相同TPPA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒TPHA試驗中梅毒螺旋體致敏羊紅細胞特點梅毒螺旋體(Nichols株)全抗原,操作步驟,1. 試劑準備：試驗前將試劑和待檢標本恢復(fù)到室溫。   2. 加稀釋液：每份樣本做4孔，加標本稀釋液加至微量反應(yīng)板孔內(nèi)，第1孔100微升，第2～4孔各25

18、微升。3. 樣本稀釋：取血清25微升加至第1孔，混勻后取25微升至第2孔，混勻后取25微升至第3孔，混勻后取25微升至第4孔，混勻后棄去25微升。4. 加對照液：第3孔加未致敏顆粒25微升，第4孔加致敏顆粒25微升。5. 混合：將反應(yīng)板置振蕩器振蕩30秒。6.反應(yīng)：置有蓋濕盒，孵育2 h，或放4℃冰箱過夜觀察結(jié)果。,結(jié)果判斷,1.觀察加未致敏顆粒的第3孔，不出現(xiàn)凝集為有效試驗。 2. 觀察凝集反應(yīng)強度：分級如下。

19、4+：顆粒光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊。     3+： 顆粒光滑覆蓋大部分孔底。     2+：顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一顆粒環(huán)。 1+： 顆粒光滑集聚覆蓋孔底，周圍有一明顯顆粒環(huán)。   ±：顆粒沉集孔底，中央形成一小點。   一：顆粒緊密沉積孔底中央。,,熒光螺旋體抗體吸

20、收試驗（FTA-ABS）,原理將有完整形態(tài)的梅毒螺旋體作為抗原，加上經(jīng)吸收劑（用Reiter螺旋體制備而成）吸收過的梅毒患者血清形成抗原抗體復(fù)合物，再加入異硫氰酸熒光素（FTIC）標記的抗人免疫球蛋白，與抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，形成熒光的抗原抗體復(fù)合物。在熒光顯微鏡下，螺旋體顯出蘋果綠色的熒光，即為陽性反應(yīng)。曾經(jīng)認為FTA-ABS試驗是檢測梅毒的“金標準”試驗。,TP-ELISA,原理用重組梅毒螺旋體抗原包被固相板條，加上梅毒血清和

21、單克隆抗體酶標記物，形成抗原抗體復(fù)合物與酶標記物結(jié)合，用酶聯(lián)檢測儀判定試驗陽性反應(yīng)。特點本法可用于大規(guī)模血清檢測。,梅毒螺旋體抗體測定(ELISA法)結(jié)果的解讀,陰性對照OD≤0.1，陽性對照OD＞0.8時實驗正常，否則實驗無效。計算方法：cut-off(co)值=0.12+陰性對照平均OD值，s/co值=病人OD值/ cut-off(co)值，s/co值大于或等于1判為陽性，s/co值小于1判為陰性注s/co值在0.5~2.0之

22、間的灰區(qū)樣本需復(fù)檢確認后報告,免疫層析,臨床應(yīng)用,梅毒螺旋體試驗的作用是作為證實試驗它們可以幫助確定非梅毒螺旋體試驗陽性反應(yīng)是真陽性還是假陽性。 一旦這些試驗呈陽性，則患者終身陽性。,方法特點,特異性強，敏感性高很少出現(xiàn)假陽性。據(jù)統(tǒng)計，在普通人群中，有1%的生物學(xué)假陽性發(fā)生。 如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清可使FTA-ABS試驗呈假陽性反應(yīng)，但大多數(shù)病例中螺旋體呈串株狀熒光。 傳染性單核細胞增多癥，可能由于嗜異性抗體所致，可使TPH

23、A呈假陽性。麻風(fēng)患者也可使特異試驗呈陽性。,臨床意義,作為RPR初篩陽性標本的確證試驗。不能作為療效觀察的指標。陽性不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合RPR結(jié)果進行診斷。,假陽性問題,存在交叉反應(yīng)的抗體處理方法：用Reiter株吸收血清中交叉反應(yīng)的抗體。,老年人抗體陽性的問題,1、真陽性 2 、假陽性：這些老年患者所患的基礎(chǔ)疾病可能使機體釋放誘導(dǎo)產(chǎn)生抗類脂抗體和/或抗T.pallidum抗體的交叉抗原；,梅毒檢測流程圖,

24、,,,,A1(ELISA),,A1+,,,A1-,,A2(PRP或TRUST）,,,A1+A2+感染：既往或現(xiàn)在,,,,A1+A2-,,,A3（TPPA）,A1+A2-A3+可能是梅毒感染需結(jié)合臨床表現(xiàn),A1+A2-A3-基本排除梅毒潛伏期,,,,,,,,,,,,,,,,美國2009年指南,梅毒血清學(xué)試驗結(jié)果的臨床意義,RPR結(jié)果解釋示意圖,陽性 陰性,,,,,,,,,TPPA結(jié)果解釋示意圖

25、,陽性 陰性,,,,,,,,,,檢 測 方 法 樣 品 種 類 血清 血漿 末梢血 腦脊液非梅毒螺旋體試驗 快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗 (RPR) ? ? 甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST） ? ? 性病研究實

26、驗室試驗 (VDRL) ? ? ?梅毒螺旋體試驗 梅毒螺旋體顆粒凝集試驗 (TPPA) ? ? 梅毒螺旋體血球凝集試驗 (TPHA) ? ? 梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（TP-ELISA） ? ? 梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測 (TP-RT) ? ? ? 熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）? ?? 化學(xué)發(fā)光免疫