大腸桿菌中蘋(píng)果酸脫氫酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶消去化修飾的鑒定.pdf

1、消去化修飾是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的罕見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，是指通過(guò)巰基進(jìn)攻不飽和氨基酸從而發(fā)生米歇爾共價(jià)加成反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)的消去化修飾蛋白只有三種，晶狀體蛋白、MAPKs和Glutathione peroxidase,而多肽有200多種。對(duì)于消去化修飾的鑒定，目前科學(xué)界并沒(méi)有較好的研究方法，為填補(bǔ)這一空白，發(fā)現(xiàn)更多的具有消去化修飾的蛋白質(zhì)及多肽，我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)室已經(jīng)成熟的標(biāo)記探針基礎(chǔ)上對(duì)大腸桿菌 BL21(DE3)裂解液進(jìn)行標(biāo)記，并鑒定到了

2、221個(gè)可能具有消去化修飾的蛋白。選取其中兩個(gè)大腸桿菌中鑒定到的可能具有消去化修飾的蛋白，蘋(píng)果酸脫氫酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)行后期條件更加嚴(yán)格的鑒定。
　　首先通過(guò)構(gòu)建重組菌在大腸桿菌 BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),選用 Ni-TED進(jìn)行親和層析純化得到純度較高的蘋(píng)果酸脫氫酶以及絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，利用成熟探針bio-SH試劑對(duì)目的蛋白進(jìn)行初步標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)二者具有較好的Michael加成效果。同時(shí)為驗(yàn)證所使用的化學(xué)探針bio-SH

3、試劑的特異性，排除反應(yīng)中可能存在非特異性，選擇在加成反應(yīng)過(guò)程中加入已驗(yàn)證的具有加成效果的DTT試劑進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果酸脫氫酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶Michael加成反應(yīng)有一定程度的減弱，近而說(shuō)明了化學(xué)探針bio-SH試劑具有特異性。
　　其次，將bio-SH試劑進(jìn)行過(guò)化學(xué)標(biāo)記的蛋白與Streptavidin-NHS beads進(jìn)行室溫孵育，對(duì)兩個(gè)目的蛋白進(jìn)行特異性富集純化，為后邊進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
　　最后，利用CRISP

4、R/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)大腸桿菌中蘋(píng)果酸脫氫酶進(jìn)行敲除，隨后通過(guò)對(duì)其基因缺陷株進(jìn)行回補(bǔ)以及表達(dá)純化。對(duì)目的蛋白進(jìn)行特異性化學(xué)標(biāo)記后，比較過(guò)表達(dá)蛋白與正常表達(dá)蛋白之間加成效率的差異。其中在缺陷株中蛋白過(guò)表達(dá)后其加成效率要高于大腸桿菌BL21(DE3)中正常表達(dá)的蛋白。
　　本課題建立在本實(shí)驗(yàn)室成熟的探針標(biāo)記基礎(chǔ)上，對(duì)大腸桿菌中蘋(píng)果酸脫氫酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，在排除非特異性反應(yīng)的條件下對(duì)二者進(jìn)行掛柱效率的檢測(cè)，并通過(guò)MD