結(jié)核分枝桿菌蛋白LipI(Rv1400c)的表達(dá)、純化及酶活性分析.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的具有悠久歷史的疾病，給人類造成了巨大的財(cái)力損失和精神壓力。結(jié)核病難治愈的原因有很多，很重要的一點(diǎn)是結(jié)核分枝桿菌可以形成肉芽腫而躲避宿主的免疫系統(tǒng)，形成長期的、慢性的感染。肉芽腫是結(jié)核病很重要的組織病理學(xué)特征結(jié)構(gòu)，在這個(gè)結(jié)構(gòu)里的大多數(shù)細(xì)菌處于持留狀態(tài)而存活很多年，在適合的壞境中可再形成具活性的分枝桿菌，導(dǎo)致宿主患病。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞包膜具有很多的脂質(zhì)成分包括：真菌酸， phthiocerol dimycocer

2、osates（PDIM），糖脂類等，這些脂質(zhì)成分參與到細(xì)菌毒力和他們的致病性。在潛伏的過程中，細(xì)菌大多數(shù)進(jìn)行的是脂質(zhì)代謝而不是碳水化合物的代謝。目前，已經(jīng)有相當(dāng)多的研究集中在脂質(zhì)部分，脂質(zhì)的重要性在結(jié)核分枝桿菌的生命周期里已經(jīng)逐漸的建立。
　　結(jié)核分枝桿菌中細(xì)胞質(zhì)被認(rèn)為是重要的脂質(zhì)儲(chǔ)存地點(diǎn)，胞內(nèi)脂質(zhì)儲(chǔ)存主要是形成細(xì)胞器，類如：脂質(zhì)包涵體。這些細(xì)胞器的本質(zhì)成分是三酰甘油，三酰甘油具有低的氧化率和高熱值，是公認(rèn)的便利的碳源和能量存儲(chǔ)成

3、分，能夠?yàn)榧?xì)菌生長提供能源。三酰甘油在脂質(zhì)包涵體中聚集最初是通過體外結(jié)核分枝桿菌感染脂肪組織直接被觀察到。在體內(nèi)，這些脂質(zhì)的存儲(chǔ)對(duì)細(xì)菌來講很重要，能夠使它們適應(yīng)環(huán)境，為進(jìn)入休眠狀態(tài)做準(zhǔn)備，這種休眠狀態(tài)類似于動(dòng)物冬眠，植物種子和微生物芽孢。在饑餓的環(huán)境下，包含在脂質(zhì)包涵體中的這些三酰甘油被水解，提供自由脂肪酸用于其他的很多代謝功能。例如：基于體外的研究，存儲(chǔ)的三酰甘油也許提供自由脂肪酸不僅用于細(xì)胞膜脂質(zhì)的構(gòu)建，還用于鐵限制的情況下蠟酯的合

4、成。
　　脂解酶廣泛的分布在生物體內(nèi)，系統(tǒng)進(jìn)化樹中形成兩個(gè)主要的分支：細(xì)菌和真核生物，包括動(dòng)植物、真菌、古細(xì)菌和原始細(xì)菌。結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的全基因組序列測(cè)定的完成及序列對(duì)比分析結(jié)果顯示，該菌具有250個(gè)基因編碼蛋白涉及到脂質(zhì)代謝，數(shù)量在整個(gè)原核界是無與倫比的，比如，在大腸桿菌中大約只有50個(gè)酶涉及到脂質(zhì)代謝。由此推斷脂質(zhì)代謝在結(jié)核分枝桿菌中具有重要的作用，獲得涉及該代謝途徑的酶、這些酶的生理學(xué)特征、證實(shí)這些基因在致病過程

5、中的作用，在結(jié)核病的研究中是最優(yōu)先的問題。然而，目前由于在體內(nèi)研究的缺乏，酶純化方法的限制，導(dǎo)致在細(xì)菌中沒有更多的信息確認(rèn)這種酶在生存能力和感染過程是不是具有重要作用。
　　本文的研究基因?yàn)镽v1400c，編碼Rv1400c蛋白。Rv1400c蛋白在結(jié)核分枝桿菌中預(yù)測(cè)為LipI的脂酶或酯酶。本文通過序列分析揭示LipI是激素敏感型脂酶/酯酶亞家族（HSL），在同源性較高的物種的基因組上的基因環(huán)境基本穩(wěn)定；通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析確定了其

6、與其他HSL家族成員、其他脂解酶成員之間的種間進(jìn)化關(guān)系。其作為融合蛋白在大腸桿菌中被克隆表達(dá)和純化，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)短碳鏈底物的活性較高，最適溫度為37℃，最適pH為8.0并且在pH6.0-9.0之間穩(wěn)定性較好，這與該家族已報(bào)道的其他成員性質(zhì)一致。當(dāng)以最適底物--對(duì)硝基苯酚丁酸酯測(cè)定時(shí)，比活為35.7U/mg。另外，其活性可以被表面活性劑SDS、CTAB及金屬陽離子Zn2+極大的抑制。通過序列比對(duì)及直接定點(diǎn)突變分析可知，其包含3個(gè)催化