大腸桿菌表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌蛋白Rv3618和融合蛋白810-H的免疫特征.pdf

1、背景:結(jié)核病致病菌是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis簡稱M.tb)。結(jié)核病預(yù)防有卡介苗(BCG),治療有一線、二線抗結(jié)核化療藥物,但全球結(jié)核病疫情仍十分嚴(yán)重,它已成為世界公共衛(wèi)生問題。結(jié)核病控制包括診斷、治療、預(yù)防,隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展,M.tb抗原不斷在結(jié)核病診斷和疫苗研制方面得到發(fā)現(xiàn)。
　　 目的:本研究通過大腸桿菌表達(dá)M.tb融合蛋白810-H和蛋白Rv3618,810-H和Rv3618

2、作為抗原,采用ELISA法檢測結(jié)核患者、健康人、肺癌患者中抗810-H或Rv3618 IgG抗體,目的是評價(jià)兩個(gè)抗原用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的價(jià)值;融合蛋白810-H(抗原)與脫脂母牛分枝桿菌無細(xì)胞(佐劑)聯(lián)合免疫小鼠對其T細(xì)胞亞群影響,探討810-H是否可作為結(jié)核病亞單位疫苗的候選抗原和脫脂母牛分枝桿菌無細(xì)胞作為佐劑的理論依據(jù)。
　　 方法:(1)PCR方法從M.tb H37Rv基因組中擴(kuò)增Rv0475基因和Rv3618基因,Rv

3、0475基因與載體PET-28a-810(本室構(gòu)建表達(dá)融合蛋白810的載體,810是Ag85B和ESAT-6的融合蛋白),Rv3618基因與載體PET-28a連接,獲得重組表達(dá)載體PET28a-810-Rv0475和PET28a-Rv3618,然后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)。IPTG誘導(dǎo)重組E.coli表達(dá)重組蛋白810-HBHA(簡稱810-H)和Rv3618,810-H包涵體溶解上清經(jīng)親和層析、疏水層析,Rv3618

4、包涵體溶解上清經(jīng)離子交換層析、疏水層析:層析純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測且純的收集管合并、透析復(fù)性。(2)810-H和Rv3618作為抗原,ELISA檢測來自108例肺結(jié)核、79例肺外結(jié)核、15例肺癌、59名PPD-健康人、50名PPD+健康人的血清中抗810-H和Rv3618的IgG抗體。(3)在微卡制備工藝基礎(chǔ)上改進(jìn),建立穩(wěn)定的脫脂母牛分枝桿菌無細(xì)胞(DMVCE)提取工藝。(4)以無細(xì)胞為佐劑,融合蛋白810-H為抗原免疫小鼠,試

5、驗(yàn)分組:重組融合蛋白810-H(抗原組)和脫脂母牛分枝桿菌無細(xì)胞單獨(dú)(佐劑組)或聯(lián)合(疫苗組)單次免疫小鼠,以生理鹽水免疫組作為對照,免疫后3周取血液和脾細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠血液和脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的變化。
　　 結(jié)果:(1)IPTG誘導(dǎo)重組E.coli獲得了大量以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白810-HBHA(簡稱810-H)和Rv3618,包涵體溶解上清經(jīng)層析獲得了大量高純度蛋白。(2)ELISA結(jié)果顯示:PPD+健康人血清中

6、抗810-H的IgG抗體的滴度高于肺結(jié)核、肺外結(jié)核、肺癌患者及PPD-健康人,其抗Rv3618 IgG抗體的滴度高于肺癌和PPD-健康人;對肺結(jié)核患者,810-H檢測敏感度為42.6％(46/108),Rv3618檢測敏感度為57.4％(62/108),兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=4.74,P=0.029);對肺外結(jié)核患者,810-H檢測敏感度29.1％(23/79),Rv3618檢測敏感度51.9％(41/79),兩者比較差異有顯

7、著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=8.51,P=0.004)。對PPD+健康人,810-H和Rv3618的IgG抗體陽性率分別為82％和80％;對PPD-健康人和肺癌,810-H和Rv3618檢測特異度均大于90％。(3)脫脂母牛分枝桿菌無細(xì)胞主要由蛋白、多糖和核酸組成。(4)血液T細(xì)胞含量比較:抗原組、佐劑組、疫苗組CD4+T、CD8+T、CD4+CD25+Foxp3+T、CD4+CD25+T、IL-4+CD4+T、IFN-γ+CD8+T和IL-

8、4+CD8+T細(xì)胞含量與生理鹽水對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);生理鹽水對照組CD4+CD25+highT細(xì)胞含量高于疫苗組(P=0.037)、低于佐劑組(P=0.024),生理鹽水對照組IFN-γ+CD4+T細(xì)胞含量低于佐劑組(P＜0.05)。脾臟T細(xì)胞含量比較:抗原組、佐劑組、疫苗組CD4+T、CD4+CD25+Foxp3+T、CD4+CD25+T與生理鹽水對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);佐劑組CD8+T、I

9、FN-γ+CD8+T和IL-4+CD8+T細(xì)胞含量高于生理鹽水對照組(P＜0.05),佐劑組CD4+CD25+highT、IFN-γ+CD4+T和IL-4+CD4+T細(xì)胞含量低于生理鹽水對照組(P＜0.05);疫苗組IFN-γ+CD4+T細(xì)胞含量低于生理鹽水對照組(P＜0.01);抗原組CD4+CD25+highT、IFN-γ+CD4+T、IL-4+CD4+T、IFN-γ+CD8+T、IL-4+CD8+T細(xì)胞含量低于生理鹽水對照組(P＜

10、0.05)。
　　 結(jié)論:(1)810-H和Rv3618用于結(jié)核病血清學(xué)診斷敏感度均低于69％,與文獻(xiàn)報(bào)道的抗原比較無明顯優(yōu)勢;但因其用于PPD+健康人IgG抗體檢測陽性率大于等于80％,提出假說:可能存在這樣抗原可用于M.tb感染血清學(xué)診斷,為了驗(yàn)證此假說,擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。若假設(shè)成立,將大大提高結(jié)核病感染率全國流調(diào)的回訪率。(2)810-H和脫脂母牛分枝桿菌無細(xì)胞組合的亞單位疫苗免疫1次誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答不顯著,需要加強(qiáng)