結(jié)核分枝桿菌廣譜脅迫蛋白R(shí)v2624c的功能研究.pdf

1、博士學(xué)位論文學(xué)校代碼：10023學(xué)號(hào)：B2011035007結(jié)核分枝桿菌廣譜脅迫蛋白R(shí)v2624c的功能研究所院：姓名：指導(dǎo)教師：導(dǎo)師小組：學(xué)科專(zhuān)業(yè)：研究方向：完成日期：病原生物學(xué)研究所賈瓊王健偉研究員王健偉研究員朱國(guó)峰研究員病原生物學(xué)結(jié)核分枝桿菌廣譜脅迫蛋白2014年4月中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士研究生學(xué)位論文中文摘要結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)是導(dǎo)致結(jié)核病的病原菌。全球約有三分之一的人口感染結(jié)核

2、分枝桿菌，每年約有兩百萬(wàn)人死于結(jié)核病，因此結(jié)核病成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一。據(jù)估計(jì)，人類(lèi)感染結(jié)核分枝桿菌后，只有10％的感染能夠轉(zhuǎn)化為活動(dòng)性肺結(jié)核；在其余90％的感染中，細(xì)菌在宿主肺部存留維持代謝休眠狀態(tài)而進(jìn)入潛伏感染期。結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染在結(jié)核病發(fā)病機(jī)理中起非常重要的作用，但是目前相關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。近年來(lái)已有研究證明結(jié)核分枝桿菌的廣譜脅迫蛋I芻(UniversalStressProtein，usP)家族與潛伏感染有關(guān)，研

3、究這類(lèi)家族蛋白的功能，以期為結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染研究提供一些線(xiàn)索。廣譜脅迫蛋白是一種古老且保守的蛋白家族，當(dāng)細(xì)菌處于環(huán)境壓力脅迫情況下，比如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，缺氧，NO脅迫，生長(zhǎng)環(huán)境中有重金屬離子等毒性物質(zhì)存在，熱休克以及DNA損傷等，該家族蛋白參與表達(dá)調(diào)控，有助于維持細(xì)菌在壓力下存活。感染宿主的結(jié)核分枝桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后逐步形成肉芽腫，此時(shí)的結(jié)核分枝桿菌恰好就處于氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的壓力環(huán)境中。結(jié)核分枝桿菌包含十個(gè)廣譜脅迫蛋白，研究表

4、明其中一個(gè)廣譜脅迫蛋白R(shí)v2623是細(xì)菌進(jìn)入慢性感染期必須的蛋白，該蛋白能夠調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)和體外的生長(zhǎng)，并且這種調(diào)節(jié)與蛋白結(jié)合ATP的功能有關(guān)，提示該家族蛋白與結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染形成具有密切關(guān)系。本論文主要針對(duì)結(jié)核分枝桿菌廣譜脅迫蛋白R(shí)v2624c進(jìn)行功能研究。首先構(gòu)建Rv2624c在大腸桿菌(Ecoli)中的重組表達(dá)質(zhì)粒，將該蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)純化，并且用純蛋白免疫新西蘭大白兔制作抗Rv2624c的兔多克隆抗體。通過(guò)

5、對(duì)Rv2624c純蛋白進(jìn)行生化活性檢測(cè)，證實(shí)了Rv2624c具有ATP結(jié)合能力但體外單獨(dú)存在時(shí)不具有ATP酶活性。對(duì)該蛋白ATP結(jié)合保守區(qū)域的氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變后，突變體的ATP結(jié)合能力下降，證明了突變的氨基酸在蛋白對(duì)ATP的結(jié)合中起關(guān)鍵性作用。其次對(duì)過(guò)表達(dá)Rv2624c野生型和突變體的恥垢分枝桿菌進(jìn)行了繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)和斑點(diǎn)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)Rv2624c對(duì)恥垢分枝桿菌的體外生長(zhǎng)沒(méi)有影響。同時(shí)，用過(guò)表達(dá)Rv2624c野生型和突變體

6、的恥垢分枝桿菌侵染巨噬細(xì)胞THPl后比較細(xì)菌存活率，我們發(fā)現(xiàn)Rv2624c過(guò)表達(dá)的恥垢分枝桿菌的存活率高于對(duì)照菌株，且突變體的存活率趨勢(shì)與ATP結(jié)合能力大小成正比。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析表明，對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行KEGGpathway顯著性富集分析，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Rv2624c的恥垢分枝桿菌和對(duì)照菌株相比差異最大的通路是精氨酸脯氨酸代謝通路以及色氨酸代謝通路。通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證Rv2624c過(guò)表達(dá)的恥垢分枝桿菌中這兩條通路的相關(guān)基因在轉(zhuǎn)