結(jié)核分枝桿菌rv1738、tb1.7及rpfe的表達(dá)純化及免疫特性分析

1、霍如松：結(jié)核分枝桿菌R v 1 7 3 8 、T B 3 1 ．7 及R P F E 的表達(dá)純化和免疫特性分析 三結(jié)核分枝桿菌R v l 7 3 8 、T B 3 1 ．7 及R P F E 的表達(dá)純化及免疫特性分析研究生：霍如松導(dǎo)師：焦新安教授摘 要結(jié)核病( T u b e r c u l o s i s ，T B ) 是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群( M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s

2、 話(huà)c o m p l e x ，M T C ) 所引起的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病，它是現(xiàn)今世界范圍內(nèi)最主要的疾病之一。據(jù)W H O 估計(jì)，當(dāng)前全世界約有1 ／3 人口感染了結(jié)核分枝桿菌( M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ，M T B ) ，我國(guó)的結(jié)核病患者數(shù)量居世界第二位，感染人數(shù)已達(dá)到4 億。而這部分人中只有1 0 ％可能最終發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核，而絕大多數(shù)為潛伏感

3、染?？ń槊? B a c i l l eC a l m e t t e a n d G u 6 r i n ，B C G ) 是牛結(jié)核分枝桿菌的減毒株，是目前唯一用于T B 預(yù)防的疫苗，但其對(duì)潛伏感染者無(wú)效，并且存在著保護(hù)期短、免疫應(yīng)答較弱等缺陷。因此，為了減輕結(jié)核病造成的負(fù)擔(dān)，新型抗原的篩選和新型疫苗的研制迫在眉睫。有國(guó)外學(xué)者利用生物信息學(xué)的方法，預(yù)測(cè)出抗原候選分子，本研究從這些候選分子中選取了3 個(gè)評(píng)分最高的蛋白，對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)和

4、純化，并對(duì)其免疫應(yīng)答特性進(jìn)行分析。1 ．結(jié)核分枝桿菌R v l 7 3 8 、T B 3 1 ．7 及R P F E 蛋白的表達(dá)純化和鑒定以M T B 蛋白R(shí) v l 7 3 8 、T B 3 1 ．7 和R P F E 為研究對(duì)象，首先從H 3 7 R v 基因組D N A 上P C R 擴(kuò)增其相應(yīng)的編碼基因，克隆篩選和序列鑒定正確以后，利用p E T 3 0 a 或p E T 3 2 a 構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒。將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)

5、化B L 2 1 ( D E 3 ) ，誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)融合蛋白進(jìn)行親和層析純化，并通過(guò)W e s t e r n b l o t t i n g 實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白的免疫反應(yīng)性進(jìn)行分析。誘導(dǎo)表達(dá)后，S D S ．P A G E 結(jié)果顯示，各目的蛋白都得到成功表達(dá)，其中R v l 7 3 8 和R P F E 主要以可溶形式存在，而T B 3 1 ．7 主要以包涵體形式表達(dá)。對(duì)于包涵體蛋白我們采用了緩慢變復(fù)性的方法使其變?yōu)榭扇苄孕问酱嬖?。各融合蛋?/p>

6、與兔抗H 3 7 R v 多抗血清的W e s t e r nb l o t t i n g 結(jié)果都顯示出了特異性目的條帶，顯示出良好的免疫反應(yīng)性。2 ．結(jié)核分枝桿菌R v l 7 3 8 、T B 3 1 ．7 及R P F E 蛋白免疫特性分析將R v l 7 3 8 、T B 3 1 ．7 和R P F E 三種融合蛋白與D D A 佐劑等體積充分乳化后皮下接種霍如松：結(jié)核分枝桿菌R v l 7 3 8 、T B 3 1 ．7 及

7、R P F E 的表達(dá)純化和免疫特性分析 三E x p r e s s i o na n d p u r i f i c a t i o no f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i sa n t i g e n i c p r o t e i n sR v l 7 3 8 ，T B 3 1 ．7 ，R P F E a n d t h e i ri m m u n o l o

8、g i c c h a r a c t e r i s t i c s a n a l y s i sM ．S ．c a n d i d a t e ：R u s o n gH u oA d v i s o r ：P r o f ．X i n a n J i a oA b s t r a c tT u b e r c u l o s i s ( T B ) i sa c h r o n i cr e s p i r a t o r yi

9、 n f e c t i o u sd i s e a s e c a u s e db y t h ep a t h o g e nM y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s ( M T B ) ．I t h a s b e e no n e o f t h em o s t i m p o r t a n t c o n t r i b u t o r ya n dm o r

10、t i f e r o u s f a c t o r s i nt h ew o r l d ．I ti se s t i m a t e db y W H O t h a to n e t h i r d p o p u l a t i o n w a s i n f e c t e db y M T B ．T h e n u m b e r o f T B p a t i e n t si nC h i n a i st h es

11、 e c o n d i nt h e w o r l d ，a b o u t 4 0 0 m i l l i o np e o p l ei n f e c t e d ，a n d10 ％o f t h e m w i l ld e v e l o p t Oa c t i v eT B ．T h e m a j o r i t y o f i n f e c t e di n d i v i d u a l se x i s t

12、 i nc o n d i t i o n o f d o r m a n ti n f e c t i o n ．M b o v 括B a c i l l eC a l m e t t e a n dG u & i n ( B E G ) ，t h e o n l yo n e v a c c i n e a v a i l a b l ef o r T B h a s s e v e r a l d i s a d v a

13、n t a g e s ，s u c ha si n e f f e c t i v e t Os u b c l i n i c a li n f e c t i o n ，s h o r tp e r i o d o f p r o t e c ta n d l o w i m m u n e r e s p o n s e ．I no r d e r t Or e d u c e t h ei m m e n s eb u r d

14、 e n o f t u b e r c u l o s i s ，n e wv a c c i n e s o rv a c c i n a t i o ns t r a t e g i e s ，o r b o t h , a r eu r g e n t l y n e e d e d ．F o r e i g n r e s e a r c h e r s h a v e p r e d i c t e d t h ec a n

15、 d i d a t e p r o t e i n sw i t hh i g h a n t i g e n i c i t yb yu s i n gt h e b i o i n f o r m a t i c s m e t h o d s ．I nt h i ss t u d y , R v l 7 3 8 、T B 3 1 ．7 a n d R P F E o f a n t i g e n i c p r o t e i

16、 n sf r o mM T B w e r e e x p r e s s e d t h r o u g h t h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n s y s t e m , a n d t h e i r i m m u n o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c sw e r e a n a l y z e d b y m i c ev

17、a c c i n a t i o n ．1 E x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o n o fR v 17 3 8 、T B 3 1 ．7 a n dR P F Ea n t i g e n i c p r o t e i n sf r o m M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u

18、l o s i sT h e c o d i n gg e n eo f R v l 7 3 8 、T B 3 1 ．7a n dR P F E w e r ea m p l i f i e df r o mH 3 7 R v g e n o m eD N A b yP e R , a n d t h e nc l o n e di n t ot h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv

19、e c t o rp E T 3 0 a o rp E T 3 2 a ．T h er e c o m b i n a t i o ne x p r e s s i o np l a s m i dw e r et r a n s f o r m e di n t oEc o l iB L 2 1 ( D E 3 ) ，r e s p e c t i v e l y ．T h ep o s i t i v ec l o n e sw e

20、 r es c r e e n e da n d i n d u c e db y I P T G ‘t h ee x p r e s s e d f u s i o np r o t e i n sw e r e p u r i f i e db ya f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h ya s s a y sa sw e l la si d e n t i f i e db yW e s