電泳技術(shù)和常用電泳儀

1、第十六章 電泳分析儀器,本章教學(xué)要求,了解常用的電泳儀 了解電泳儀臨床應(yīng)用 熟悉常用電泳儀的基本結(jié)構(gòu)、電泳方法 熟悉毛細(xì)管電泳儀基本原理、基本結(jié)構(gòu) 掌握電泳基本原理 掌握毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)、分離模式 掌握電泳儀的維護(hù)保養(yǎng)及故障排除,內(nèi) 容 提 要,第一節(jié) 電泳原理 第二節(jié) 常用電泳方法 第三節(jié) 常用電泳儀的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo) 第四節(jié)

2、常用電泳儀簡(jiǎn)介 第五節(jié) 毛細(xì)管電泳 第六節(jié) 電泳儀的維護(hù)保養(yǎng)及故障排除 第七節(jié) 電泳儀的臨床應(yīng)用,電泳（electrophoresis）是指帶電荷的溶質(zhì)或粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。利用電泳現(xiàn)象將多組分物質(zhì)分離、分析的技術(shù)叫做電泳技術(shù)（electrophoresis technique）。可以實(shí)現(xiàn)電泳分離技術(shù)的儀器稱之為電泳儀（electrophoresister）。,概 述,臨床常

3、用的電泳分析方法主要有醋酸纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和毛細(xì)管電泳等。 目前，電泳技術(shù)已廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷酸、無(wú)機(jī)離子等成份的分離和鑒定，甚至還用于細(xì)胞與病毒的研究。,概 述,第一節(jié) 電泳原理,一、電泳的基本原理 物質(zhì)分子在正常情況下一般不帶電，即所帶正負(fù)電荷量相等，故不顯示帶電性。但是在一定的物理作用或化學(xué)反應(yīng)條件下，某些物質(zhì)分子會(huì)成為帶電的離子（或粒子），不同的物質(zhì)

4、，由于其帶電性質(zhì)、顆粒形狀和大小不同，因而在一定的電場(chǎng) 中它們的移動(dòng)方向和移 動(dòng)速度也不同，因此可 使它們分離。,電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象,第一節(jié) 電泳原理,若將帶凈電荷Q的粒子放入電場(chǎng)，則該粒子所受到的電荷引力為：F引=E Q （16-1） 在溶液中,運(yùn)動(dòng)粒子與溶液之間存在阻力F阻 F阻=6πrηV

5、 （16-2） 當(dāng)F引=F阻時(shí) EQ= 6πrηV V = EQ/6πrη （16-3） 由上式可以看出,粒子的移動(dòng)速度(泳動(dòng)速度V)與電場(chǎng)強(qiáng)度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度(η)成反比。,第一節(jié) 電泳原理,二、影響電泳的外界因素 （一）電場(chǎng)強(qiáng)度

6、 （二）溶液的pH值 （三）溶液的離子強(qiáng)度 （四）電滲作用 （五）粒子的遷移率 （六）吸附作用,V = EQ/6πrη,第二節(jié) 常用電泳方法,一、紙電泳 指用濾紙作為支持載體的電泳方法。是最早使用的區(qū)帶電泳。,將濾紙條水平地架設(shè)在兩個(gè)裝有緩沖溶液的容器之間，樣品點(diǎn)于濾紙中央。當(dāng)濾紙條被緩沖液潤(rùn)濕后，再蓋上絕緣密封罩，即可由電泳電源輸

7、入直流電壓（100V～1000V）進(jìn)行電泳。,平臥式電泳槽裝置示意圖,第二節(jié) 常用電泳方法,二、醋酸纖維素薄膜電泳 電泳時(shí)經(jīng)過(guò)膜的預(yù)處理、加樣、電泳、染色、脫色與透明即可得到滿意的分離效果。此電泳的特點(diǎn)是分離速度快、 電泳時(shí)間短、樣品 用量少。因此特別 適合于病理情況下 微量異常蛋白的檢測(cè)。,血清蛋白的電泳圖譜,第二節(jié) 常用電泳方法,三、凝膠電泳 由區(qū)帶電泳中派生出的一種用凝膠物質(zhì)作支持物進(jìn)行電泳

8、的方式。 凝膠電泳中的瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳是普通電泳中應(yīng)用最多 的兩種形式。 目前，這種辦法被廣泛用來(lái)分析蛋白質(zhì)和核酸。,凝膠電泳圖,第二節(jié) 常用電泳方法,四、等電聚焦電泳 1．等電聚焦電泳過(guò)程 一種利用有pH值梯度的介質(zhì)，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。 在一個(gè)穩(wěn)定連續(xù)的線性pH梯度的溶液（兩性載體電解質(zhì)）中進(jìn)行分離，每一種被分離的兩性物質(zhì)都移向與它的等電點(diǎn)相一致的pH位置

9、，在那里不再移動(dòng)（稱為聚焦）。,凈電荷與PH的關(guān)系曲線,第二節(jié) 常用電泳方法,2．等電聚焦電泳的特點(diǎn) ①使用兩性載體電解質(zhì)，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、線性的pH梯度；②由于“聚焦效應(yīng)”，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區(qū)帶界面；③電泳速度快;④分辨率高;⑤加入樣品的位置可任意選擇；⑥可用于測(cè)定蛋白質(zhì)類物質(zhì)的等電點(diǎn);⑦適用于中、大分子量（如蛋白質(zhì)、肽類、同工酶等）生物組分的分離分析。,第二節(jié) 常用電泳方法,五、等速電泳

10、 采用兩種不同濃度的電解質(zhì)，一種為前導(dǎo)電解質(zhì)，充滿整個(gè)毛細(xì)管柱；另一種為尾隨電解質(zhì)，置于一端的電泳槽中。前導(dǎo)電解質(zhì)的遷移率高于任何樣品組分，尾隨電解質(zhì)則低于任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)分離。,等速電泳示意圖,第二節(jié) 常用電泳方法,六、雙向凝膠電泳（二維電泳） 第一向采用等電聚焦 根據(jù)復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分中各個(gè)蛋白質(zhì)的

11、PI的不同，將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。 第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）就是按蛋白質(zhì)分子量的大小使其在垂直方向進(jìn)行分離。其結(jié)果不再是條帶狀，而是呈現(xiàn)為斑點(diǎn)狀。,等電聚焦儀,,雙向凝膠電泳示意圖,第二節(jié) 常用電泳方法,六、雙向凝膠電泳（二維電泳）,,第二節(jié) 常用電泳方法,六、雙向凝膠電泳儀器結(jié)構(gòu),制膠板、電泳槽、電源、計(jì)算機(jī)、掃描儀等,第二節(jié) 常用電泳方法,七、免疫電泳 免疫電泳是瓊

12、脂平板電泳和雙相免疫擴(kuò)散兩種方法的結(jié)合。將抗原樣品在瓊脂平板上先進(jìn)行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開；然后加入抗體做雙相免疫擴(kuò)散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴(kuò)散而相遇，在二者比例適當(dāng)?shù)牡胤?，形成肉眼可見的沉淀弧?第三節(jié) 常用電泳儀的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo),一、常用電泳設(shè)備的基本結(jié)構(gòu) （一）電源 （二）電泳槽 （三）附加裝置,垂直電泳儀器裝置示意圖,實(shí)驗(yàn)室常用電泳槽和電泳,第三節(jié) 常用電泳

13、儀的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo),垂直板電泳槽和電源,水平電泳槽、電泳儀,凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上，將凝膠直接浸入緩沖液中。常用于瓊脂糖電泳分離核酸。,電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板，在玻璃平板中間制備電泳凝膠。垂直板式電泳常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。,第三節(jié) 常用電泳儀的基本結(jié)構(gòu)及技術(shù)指標(biāo),二、電泳儀的主要技術(shù)指標(biāo) 1．輸出電壓 6．功率穩(wěn)定度 2．輸出電流 7．連續(xù)工作時(shí)間

14、 3．輸出功率 8．顯示方式 4．電壓穩(wěn)定度 9．定時(shí)方式 5．電流穩(wěn)定度,第四節(jié) 常用電泳儀簡(jiǎn)介,一、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀是穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀是目前國(guó)內(nèi)中、低壓電泳實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的電泳儀之一。其輸出電壓的調(diào)節(jié)范圍為0V～600V、輸出電流為0 mA～100mA。這種電泳儀工作穩(wěn)定性好、調(diào)節(jié)范圍寬，并設(shè)有完善的短路保護(hù)電路和過(guò)流保護(hù)電路。,穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,第四節(jié) 常

15、用電泳儀簡(jiǎn)介,二、全自動(dòng)醋纖膜電泳儀 全自動(dòng)醋纖膜電泳儀為全自動(dòng)電泳儀，有可見光單系統(tǒng)，使用醋酸纖維薄膜電泳片，優(yōu)點(diǎn)為自動(dòng)化程度高。只需將樣品、試劑、電泳片放好，人員可離機(jī)完成實(shí)驗(yàn)并得到結(jié)果。,第四節(jié) 常用電泳儀簡(jiǎn)介,三、全自動(dòng)熒光/可見光雙系統(tǒng)電泳儀 全自動(dòng)熒光/可見光雙系統(tǒng)電泳儀只需將樣品、試劑和瓊脂糖凝膠電泳膠片放好后，其最大優(yōu)點(diǎn)是熒光系統(tǒng)全自動(dòng)，只需要20min即可完成電泳分析，速度非?？?。操

16、作人員可離機(jī)完成實(shí)驗(yàn)并得到結(jié)果。,第四節(jié) 常用電泳儀簡(jiǎn)介,四、全自動(dòng)瓊脂糖電泳儀 全自動(dòng)瓊脂糖電泳儀，有可見光單系統(tǒng)，使用瓊脂糖凝膠電泳膠片。靈敏度高，可適用于低濃度蛋白檢驗(yàn)，如尿蛋白、腦脊液蛋白、同工酶的分離。但其自動(dòng)化程度較差。 由于這類電泳儀所能做的項(xiàng)目較多，且靈敏度較高，仍為許多實(shí)驗(yàn)室所接受。,第四節(jié) 常用電泳儀簡(jiǎn)介,五、全自動(dòng)電泳分析系統(tǒng) 全自動(dòng)電泳分析系統(tǒng)，將上述儀器的優(yōu)點(diǎn)集于

17、一身，儀器自動(dòng)點(diǎn)樣、電泳、呈色（或染色、脫色）、烘干，自動(dòng)化程度非常高?？捎酶鞣N電泳片，包括瓊脂片、醋酸片、聚丙烯酰胺等，采用可見光及熒光呈色雙系統(tǒng)，是一種較理想的電泳儀。,全自動(dòng)電泳儀,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳,一、毛細(xì)管電泳的基本工作原理 溶液中的帶電粒子以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，沿毛細(xì)管通道，以不同速度向與其所帶電荷相反的電極方向遷移，并依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離。,高效毛細(xì)管電泳儀,第五節(jié)

18、毛細(xì)管電泳,毛細(xì)管電泳儀裝置示意圖,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳,三、毛細(xì)管電泳的特點(diǎn) 1. 高靈敏度 2. 高速度 3. 高分辨率 4. 樣品少 5. 自動(dòng)化程度高 6. 應(yīng)用范圍廣,TriSepTM-2010GV pCEC System,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳,三、毛細(xì)管電泳的分離模式 （一）毛細(xì)管區(qū)帶電泳 它是通過(guò)在充滿電解質(zhì)溶液的毛細(xì)管中，不同質(zhì)荷比大小的組分，在

19、電場(chǎng)的作用下，依遷移速度的不同而進(jìn)行分離。 根據(jù)組分的遷移時(shí)間進(jìn)行 定性，根據(jù)電泳峰的峰面 積或峰高進(jìn)行定量分析。,毛細(xì)血管區(qū)帶電泳原理圖,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳,（二）毛細(xì)管凝膠電泳 毛細(xì)管凝膠電泳(CGE) 常用聚丙烯酰胺在毛細(xì)管內(nèi)交聯(lián)制成凝膠柱，依據(jù)分離支撐物的分離作用不同，CGE又分為非變

20、性CGE和變性CGE，前者以分子篩、電荷／質(zhì)量比的作用進(jìn)行分離；后者則以質(zhì)量、分子篩的作用進(jìn)行分離。 適用于分離、測(cè)定肽類、蛋白質(zhì)、DNA類物質(zhì)的分離。,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳,（三）毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC) MECC系統(tǒng)中存在兩個(gè)相：流動(dòng)的水相和起到固定相作用的膠束相。 在含有膠束的流動(dòng)相中，溶質(zhì)在“水相”和“膠束相”(準(zhǔn)固定相)之間進(jìn)行分配，即使是中性溶質(zhì)，因其本身疏水性不同，在二者之間的分

21、配也會(huì)有差異，疏水性強(qiáng)的溶質(zhì)在“膠束相”中停留時(shí)間長(zhǎng)，遷移速度就慢。反之，親水性強(qiáng)的溶質(zhì)遷移速度就快，最終中性溶質(zhì)將依其疏水性不同而得以分離。,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳,毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜原理圖,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳,（四）毛細(xì)管等電聚焦電泳 不同等電點(diǎn)的分子分別聚集在不同的位置上，不作遷移而彼此分離，這就是等電聚焦分離過(guò)程。毛細(xì)管的等電聚焦是在毛細(xì)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)的等電聚焦過(guò)程，具有極高的分辨率，通?？梢苑蛛x等電點(diǎn)差異小于 0.0

22、1pH單位的兩種蛋白質(zhì)，例如肽類、蛋白質(zhì)的分離。,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳,（五）毛細(xì)管等速電泳 毛細(xì)管內(nèi)首先導(dǎo)入具有比被分離各組分高電泳淌度的前導(dǎo)電解質(zhì)，然后進(jìn)樣，隨后再導(dǎo)入比各分離組份低電泳淌度的尾隨電解質(zhì)，在強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，各被分離組分在前導(dǎo)電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中發(fā)生分離。,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳,（六）毛細(xì)管電色譜 它包含了電泳和色譜兩種機(jī)制，是在毛細(xì)管中填充 或在毛細(xì)管壁 上鍵合（或涂壁

23、）固 定相，從而構(gòu)成毛細(xì) 管色譜柱，依靠電滲 流推動(dòng)流動(dòng)相，攜帶 樣品遷移，根據(jù)樣品 分子的質(zhì)荷比、分子 尺寸及分配系數(shù)的差 別而分離。,CEC-加壓毛細(xì)管電色譜儀,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳,（七）毛細(xì)管電泳芯片 毛細(xì)管電泳芯片是在常規(guī)毛細(xì)管電泳的原理和技術(shù)基礎(chǔ)上，利用微加工技術(shù)在平方厘米級(jí)大小的芯片上加工出各種微細(xì)結(jié)構(gòu)，如通道和其它功能單元，通過(guò)不同的通道、反應(yīng)器、檢測(cè)單元等的設(shè)計(jì)和

24、布局，實(shí)現(xiàn)樣品的進(jìn)樣、反應(yīng)、分離和檢測(cè)，是一種多功能化的快速、高效和低耗的微型實(shí)驗(yàn)裝置。,第五節(jié) 毛細(xì)管電泳,四、毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu) 毛細(xì)管電泳儀的結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜，主要有高壓毛細(xì)管柱、檢測(cè)器，以及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液槽。 （一）毛細(xì)管柱 （二）檢測(cè)器 （三）毛細(xì)管電泳 法的進(jìn)樣技術(shù),毛細(xì)管電泳儀,第六節(jié) 電泳儀的維護(hù)保養(yǎng)及故障排除,一、電泳儀的維護(hù)保養(yǎng) （一

25、）每日維護(hù) （二）每周維護(hù) （三）每月維護(hù) （四）按需進(jìn)行的維護(hù),TriSep 毛細(xì)管電泳儀,第六節(jié) 電泳儀的維護(hù)保養(yǎng)及故障排除,二、電泳儀的故障排除 電泳儀是精密儀器，在操作過(guò)程中要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，但不可避免會(huì)出現(xiàn)各種各樣的故障，當(dāng)儀器提示有故障時(shí)，應(yīng)立即處理。,,BECKMAN COULTER毛細(xì)管電泳儀,第六節(jié) 電泳儀的維護(hù)保養(yǎng)及故障排除,毛細(xì)管電泳儀常見故障及故障排除

26、方法,第七節(jié) 電泳儀的臨床應(yīng)用,一、 血清蛋白電泳 新鮮血清經(jīng)醋酸纖維薄膜或瓊脂糖電泳、染色后，通常可見5條帶，即清蛋白、?1、?2、?和?球蛋白。許多疾病總血清蛋白濃度和各蛋白組分的比例有所改變，通過(guò)血清蛋白電泳圖譜能幫助我們對(duì)某些疾病進(jìn)行診斷及鑒別診斷。,血清蛋白電泳圖譜,第七節(jié) 電泳儀的臨床應(yīng)用,二、尿蛋白電泳 臨床進(jìn)行尿蛋白電泳的主要目的是：①確定尿蛋白的來(lái)源；②了解腎臟

27、病變的嚴(yán)重程度（選擇性蛋白尿與非選擇性蛋白尿），從而有助于診斷和預(yù)后的判斷。 當(dāng)不能進(jìn)行腎活檢時(shí) ，尿蛋白電泳結(jié)果能 很好地協(xié)助臨床判斷 腎臟的主要損害。,尿蛋白電泳圖譜,第七節(jié) 電泳儀的臨床應(yīng)用,三、血紅蛋白及糖化血紅蛋白電泳 應(yīng)用電泳法鑒別患者血液中Hb的類型及含量，對(duì)于貧血類型的臨床診斷及治療具有重大意義。Hb電泳結(jié)果應(yīng)根據(jù)不同年齡人群進(jìn)行分析。,血紅蛋白電泳圖譜,第七節(jié) 電泳儀的臨床應(yīng)用,四、

28、免疫固定電泳 可對(duì)各類Ig及其輕鏈進(jìn)行分型，最常用于臨床常規(guī)M蛋白的分型與鑒定。一般用于單克隆Ig增殖病、單克隆Ig病、本周氏蛋白和游離輕鏈病、多組分單克隆Ig病、重鏈病、 CSF寡克隆蛋白鑒 別、多克隆Ig病的 診斷和鑒別診斷,免疫固定電泳圖譜,第七節(jié) 電泳儀的臨床應(yīng)用,五、 同工酶電泳 同工酶電泳用于臨床上常見的同工酶或同工酶亞型分析。 1．乳酸脫氫酶(LD/LDH)同工酶 2．肌