瑞士乳桿菌MB2-1胞外多糖制備、結(jié)構(gòu)和生理功能的研究.pdf

1、乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)由于其優(yōu)良的物化特性和生理活性已成為廣大研究者廣泛研究的熱點(diǎn)。乳酸菌EPS是指乳酸菌在其生長代謝過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，它包括依附在細(xì)胞壁上的莢膜多糖和分泌到細(xì)胞外的粘液多糖。據(jù)報(bào)道，EPS不僅具有改善發(fā)酵乳制品口感、組織狀態(tài)和流變性的效果，還能作為穩(wěn)定劑、乳化劑、增稠劑等食品添加劑的替代品，不僅如此，許多乳酸菌EPS已被證實(shí)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗炎癥以及降低膽固醇等生

2、理活性。
　　本論文以從新疆賽里木酸奶中篩選到的一株具有產(chǎn)EPS的瑞士乳桿菌MB2-1為研究對(duì)象，對(duì)其EPS的分離純化、結(jié)構(gòu)特征和生理功能等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。
　　1、采用8％(W/V)乳清粉培養(yǎng)基于50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)（溫度42℃，接種量4％，發(fā)酵時(shí)間32 h)，發(fā)酵液經(jīng)過離心除菌體收集上清液，然后用終濃度為4％(W/V)的三氯乙酸(TCA)去除上清液中的蛋白質(zhì)，離心收集上清液并減壓濃縮，用3倍體積的無水乙醇沉淀得到粗

3、多糖，得率為789 mg/L。
　　2、獲得的粗多糖依次利用DEAE-52陰離子交換柱和Sephadex G-100凝膠柱進(jìn)行分離純化，可以得到三個(gè)純組分，分別命名為LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3。根據(jù)對(duì)比DEAE-52柱層析前的粗多糖質(zhì)量和凝膠柱G-100純化后的多糖組分的含量，可得到LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3的得率分別為10.47、46.96和2.81％，總回收率為60.24％。在高效液相色

4、譜上，LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3均顯示單一對(duì)稱的色譜峰，分子量分別為2.08×105、2.04×105和2.01×105Da。分別采用考馬斯亮藍(lán)法、硫酸-苯酚法、間羥基聯(lián)苯比色法和氯化鋇-明膠比濁法，測(cè)定粗多糖和三個(gè)多糖純組分中蛋白質(zhì)、總糖、糖醛酸和硫酸基的含量，結(jié)果表明，粗多糖、LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3的蛋白質(zhì)含量分別為4.08％、未檢出、未檢出和0.29％;中性糖含量分別為71.68、97.

5、85、94.54和67.62％;糖醛酸含量分別為2.98、0.53、1.96和2.53％;硫酸基含量分別為1.43、0.27、0.42和0.87％。
　　3、通過多種方法進(jìn)行了LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3的結(jié)構(gòu)鑒定。多糖的紫外全波長掃描結(jié)果顯示LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3在190～500nm的波長范圍內(nèi)無核酸和蛋白質(zhì)的吸收峰，其中LHEPS-3含有微量的蛋白質(zhì)。單糖組成的分析結(jié)果表明LHEPS-

6、1、LHEPS-2和LHEPS-3均是由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其各自單糖組成的摩爾比為1∶2.75∶1.33，9.34∶1.43∶1和2.96∶1∶1.17。LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3紅外光譜分析的結(jié)果表明，三者都具有多糖的特征吸收峰，均含有吡喃糖苷;LHEPS-1含有β-D-Glc和α-D-Man，LHEPS-2和LHEPS-3的紅外光譜圖基本相似，但單糖組成的比例不同;此外，LHEPS-3中含有N-H的彎曲

7、振動(dòng)峰，說明LHEPS-3中含有少量的蛋白質(zhì)。甲基化反應(yīng)和氣質(zhì)聯(lián)用分析的結(jié)果說明，LHEPS-1的主鏈上存在→4，6-D-Manp-(1→和→3，6-D-Glcp-(1→，且有兩個(gè)分支結(jié)構(gòu)，存在于甘露糖殘基上和葡萄糖殘基鏈上，分支結(jié)構(gòu)的末端為D-Glcp和D-Galp; LHEPS-2糖鏈的骨架主要由→4-D-Manp-(1→和→6-D-Manp-（1→組成，另外→4-D-Galp-（1→和→6-D-Glcp-(1→可能存在于骨架鏈上或

8、分支結(jié)構(gòu)上;分支結(jié)構(gòu)上的分支點(diǎn)在甘露糖殘基鏈上，且分支結(jié)構(gòu)的末端為D-Glcp; LHEPS-3糖鏈的骨架存在→4，6-D-Manp-(1→和→3，6-D-Manp-(1→，并且各自含有一個(gè)分支結(jié)構(gòu)，分支結(jié)構(gòu)的末端為D-Glcp和D-Galp。將1DNMR和2D NMR的結(jié)果與上述分析結(jié)果相結(jié)合，可推測(cè)出LHEPS-1、LHEPS-2和LHEPS-3的結(jié)構(gòu)如下:
　　LHEPS-1:α-D-Glc-(1→3)-α-D-Glc-(1

9、→6)-α-D-Glc1↓6β-D-Gal-(1→2)-β-D-Glc1↓6[→4)-α-D-Man-(1→6)-α-D-Man-(1→4)-β-D-Glc-(1→3)-β-D-Glc-(1→4)-α-D-Gal-(1→]n
　　LHEPS-2:α-D-Glc-(1→4)-α-D-Man-(1→6）-α-D-Glc1↓6[→4）-α-D-Man-(1→6)-α-D-Man-α-(1→4)-α-D-Gal-(1→] n
　　L

10、HEPS-3:β-D-Gal-（1→3)-α-D-Man-(1→2）-β-D-Man1↓6[→4)-α-D-Man-(1→6)-α-D-Man-(1→3）-β-D-Man-(1→4）-α-D-Gal-(1→] n6↑1α-D-Glc-(1→4)-α-D-Man-(1→6)-α-D-Glc
　　掃描電鏡結(jié)果顯示，LHEPS-1的表面光滑，成碎片狀的聚集態(tài)，LHEPS-2和LHEPS-3為管狀的聚集態(tài)，彼此堆積呈發(fā)射狀且內(nèi)部中空。三種

11、多糖組分的原子力顯微鏡的結(jié)果表明，多糖表面形成道釘狀的突起，大小不一，小的高度為2nm，大的高度可達(dá)380 nm。
　　4、體外抗氧化能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胞外多糖具有較強(qiáng)的超氧陰離子自由基清除活性，中等的羥基自由基清除活性和金屬離子螯合能力，較弱的DPPH自由基清除活性。多糖樣品體外抗氧化能力的順序依次為粗多糖＞ LHEPS-3＞LHEPS-2＞LHEPS-1，其中超氧陰離子自由基清除能力的順序?yàn)榇侄嗵牵綥HEPS-2＞LHEPS

12、-3＞LHEPS-1。
　　5、利用體外腫瘤細(xì)胞模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacilus helveticus MB2-1 EPS對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2、人胃癌細(xì)胞BGC-823和人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的生長均有一定的抑制作用，其中對(duì)HepG-2細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)，BGC-823次之，Caco-2最弱，所以本課題對(duì)HepG-2細(xì)胞進(jìn)行深入研究。后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EPS作用HepG-2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的乳酸脫氫酶活力隨著多糖