日本血吸蟲(chóng)23kDa膜蛋白(Sj23)和脂肪酸結(jié)合蛋白(Sj14)的雙價(jià)DNA疫苗免疫保護(hù)性研究.pdf

1、日本血吸蟲(chóng)病是一種廣泛流行的人獸共患寄生蟲(chóng)性疾病，導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率。盡管有一些抗血吸蟲(chóng)病的藥物和公共衛(wèi)生控制措施，血吸蟲(chóng)病并沒(méi)有被控制，局部地區(qū)仍在擴(kuò)散。在大多數(shù)病例中化療能有效控制血吸蟲(chóng)病的病程發(fā)展，但流行區(qū)病人迅速的再感染需要反復(fù)的化療。這不僅增加治療成本，而且有引起耐藥性的危險(xiǎn)。因此，研制安全有效血吸蟲(chóng)病疫苗是長(zhǎng)期綜合防治血吸蟲(chóng)病的重要措施之一。
　　 自1990年Wolff 報(bào)道編碼外源蛋白的質(zhì)粒DNA注射到小鼠

2、的骨骼肌，外源蛋白能在骨骼肌中持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)以來(lái)，抗血吸蟲(chóng)病疫苗進(jìn)入核酸疫苗的新階段。核酸疫苗相對(duì)于傳統(tǒng)的致弱疫苗和亞單位疫苗具有低成本，熱穩(wěn)定性和能誘導(dǎo)廣泛的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。人們陸續(xù)制備出許多單價(jià)DNA疫苗，盡管可以產(chǎn)生特異性抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，但與致弱尾蚴產(chǎn)生的高保護(hù)力相比，單價(jià)DNA疫苗的免疫保護(hù)效果并不令人滿意，至今還沒(méi)有一商品化的疫苗問(wèn)世。究其原因血吸蟲(chóng)是多細(xì)胞生物,基因組比細(xì)菌病毒復(fù)雜得多，且在與宿主長(zhǎng)期

3、進(jìn)化的過(guò)程中產(chǎn)生了多種免疫逃避機(jī)制，所以單一的疫苗難以誘導(dǎo)出足夠有效的保護(hù)力抵御攻擊感染。發(fā)展多價(jià)疫苗是提高保護(hù)力的新策略，它具有多個(gè)保護(hù)性表位分子，能針對(duì)血吸蟲(chóng)不同種株和生活史中不同階段的特異性抗原產(chǎn)生較好的保護(hù)力。
　　 本研究將不同的日本血吸蟲(chóng)抗原分子23kDa膜蛋白(Sj23)和脂肪酸結(jié)合蛋白(Sj14)引入到同一真核表達(dá)載體pVIVO2-mcs，構(gòu)建雙價(jià)共表達(dá)核酸疫苗，以期提高免疫保護(hù)效果。以BALB/c小鼠為動(dòng)物模型

4、觀察了單價(jià)疫苗，共表達(dá)、融合表達(dá)雙價(jià)疫苗、雞尾酒混合雙價(jià)核酸疫苗和四價(jià)疫苗的免疫保護(hù)效果，并初步以免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、末次免疫后攻擊感染的時(shí)間四個(gè)因素探討了雙價(jià)疫苗的免疫優(yōu)化方案。
　　 研究工作分為以下四個(gè)部分:
　　 一．日本血吸蟲(chóng)Sj23與Sj14的雙價(jià)共表達(dá)DNA疫苗(pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14)的構(gòu)建和鑒定
　　 以pVIVO2-IL12

5、-Sj23和 pVIVO2-IL12-Sj14為模板,根據(jù)Sj23、Sj14基因序列各設(shè)計(jì)2對(duì)引物，用PCR技術(shù)得到Sj23和Sj14的DNA片段。將這兩個(gè)片段分別插入到真核表達(dá)載體pVIVO2-mcs的一個(gè)多克隆位點(diǎn)(BamHI/EcoRI),構(gòu)建兩個(gè)單價(jià)DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj14。與此類似，用含有不同酶切位點(diǎn)的另一對(duì)引物通過(guò)PCR技術(shù)得到Sj23和Sj14的DNA片段，經(jīng)酶切后插入單價(jià)疫

6、苗的另一個(gè)位點(diǎn)(AvrII/BspHI)上，構(gòu)建雙價(jià)DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14，酶切分析鑒定陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果：雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pVIVO2-mcs-Sj23、pVIVO2-mcs-Sj14、pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14和pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23，所得小片段的大小分別是440bp和710bp。測(cè)序結(jié)果顯示插入的cDNA片段與公布的

7、Sj23或Sj14片段序列一致，提示質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 華中科技大學(xué)生命科學(xué)院利用重組PCR技術(shù)將日本血吸蟲(chóng)Sj14和Sj23的基因片段用(Gly4Ser)3進(jìn)行連接,得到融合基因Sj14·Sj23和Sj23·Sj14,再將該片段重組于pVIVO2-mcs載體多克隆位點(diǎn)(BamHI/EcoRI)中,成功構(gòu)建兩種融合雙價(jià)DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14，pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23。與此類似，用含有

8、不同酶切位點(diǎn)的另一對(duì)引物通過(guò)PCR技術(shù)得到融合基因Sj14·Sj23和Sj23·Sj14，經(jīng)酶切后插入雙價(jià)疫苗的另一個(gè)位點(diǎn)(AvrII/BspHI)上，成功構(gòu)建兩種四價(jià)DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14/Sj14·Sj23，pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23/Sj23·Sj14。將pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14和pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14以等量混合，獲得雞尾酒混合疫苗。
　　 選用的

9、載體pVIVO2-mcs是Invivogen公司新一代的具有兩個(gè)翻譯單位的雙基因真核表達(dá)載體，由于真核表達(dá)載體具有人鐵蛋白FerL和 FerH復(fù)合啟動(dòng)子，可以消除兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄干擾。兩個(gè)啟動(dòng)子的活性可進(jìn)一步被SV40和CMV增強(qiáng)子增強(qiáng)。
　　 二．日本血吸蟲(chóng)Sj23與Sj14的雙價(jià)共表達(dá)DNA疫苗(pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23)的真核表達(dá)
　　 在進(jìn)行動(dòng)物免疫接種前，必須確定構(gòu)建的DNA質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞

10、合成表達(dá)相應(yīng)的目的抗原分子。為此，選取雙價(jià)共表達(dá)DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23，觀察其在體內(nèi)外的真核表達(dá)。
　　 1．質(zhì)粒pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23的體外瞬時(shí)表達(dá)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs進(jìn)行體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Sj14和Sj23 mRNA的表達(dá)，以間接免疫熒光法檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)。

11、　　 RT-PCR結(jié)果顯示pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23轉(zhuǎn)染后獲得了440bp和710bp兩條目的條帶，間接免疫熒光染色顯示部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞膜和胞漿中有目的蛋白的表達(dá)。表明上述重組質(zhì)粒能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
　　 2．質(zhì)粒pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23在BALB/c小鼠體內(nèi)骨骼肌細(xì)胞的表達(dá)及持續(xù)時(shí)間18只BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩組，分別以pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs質(zhì)

12、粒100μg/只經(jīng)股四頭肌免疫，免疫后4周、8周、12周、16周、20周、24周分別處死小鼠，取注射側(cè)股四頭肌做冰凍切片，間接免疫熒光定位顯示免疫小鼠肌細(xì)胞的胞膜和胞漿均獲得目的蛋白的表達(dá)，且表達(dá)持續(xù)6個(gè)月以上。
　　 三.DNA疫苗免疫保護(hù)力的觀察
　　 120只5周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為12組,每組小鼠分別肌肉免疫下述DNA各100μg：pVIVO2-mcs，pVIVO2-mcs-Sj23，pVIVO2-mc

13、s-Sj14，pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14，pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23，pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14，pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23，pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14/Sj14·Sj23，pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23/Sj23·Sj14，pVIVO2-Sj23/Sj14+香菇多糖(100μg)，雞尾酒式混合疫苗(pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14與pVIVO2-m

14、cs-Sj23.Sj14各50μg)，對(duì)照組各鼠免疫生理鹽水100μl。免疫后4周，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染40±2條日本血吸蟲(chóng)尾蚴，感染后6周剖殺，收集成蟲(chóng)計(jì)算蟲(chóng)荷均數(shù)并計(jì)算每克肝組織的蟲(chóng)卵數(shù)(EPG)。用TY70圖像分析系統(tǒng)，測(cè)量肝臟切片中單卵肉芽腫直徑(μm)，以減蟲(chóng)率、肝減卵率和單個(gè)蟲(chóng)卵肉芽腫直徑減小率評(píng)價(jià)各組質(zhì)粒免疫保護(hù)力。
　　 四．日本血吸蟲(chóng)Sj23與Sj14的雙價(jià)共表達(dá)DNA疫苗(pVIVO2-mcs-Sj14/S

15、j23)免疫優(yōu)化方案的研究
　　 為探討最佳免疫條件，選取雙價(jià)DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23進(jìn)行第二次動(dòng)物試驗(yàn)。應(yīng)用SPSS12.0軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的免疫正交方案，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，以最少的實(shí)驗(yàn)組數(shù)獲得與設(shè)置所有實(shí)驗(yàn)組相近的結(jié)果。
　　 本課題研究初步得出以下結(jié)論：
　　 1．成功構(gòu)建兩種單價(jià)DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23，pVIVO2-mcs-Sj14和兩種共表達(dá)雙價(jià)DNA疫苗p

16、VIVO2-mcs-Sj23/Sj14和pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23。
　　 2．雙價(jià)DNA疫苗可以在體內(nèi)外表達(dá)，且體內(nèi)表達(dá)持續(xù)時(shí)間至少在6個(gè)月以上。
　　 3．適宜佐劑可增強(qiáng)抗原免疫力和維護(hù)免疫的回憶性效應(yīng)，首次提出香菇多糖是DNA疫苗有效的佐劑，取得很好的結(jié)果，值得進(jìn)一步研究。
　　 4．為提高DNA疫苗保護(hù)力，我們首先采用多價(jià)多位點(diǎn)的技術(shù)路線，以共表達(dá)、融合表達(dá)和雞尾酒混合三種形式構(gòu)建雙價(jià)DNA

17、疫苗，均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較顯著的抗血吸蟲(chóng)攻擊感染的免疫保護(hù)力(有五組減蟲(chóng)率超過(guò)50[％]),保護(hù)作用顯著高于單價(jià)DNA疫苗，無(wú)疑在多價(jià)疫苗的設(shè)計(jì)上提供了新的思路和依據(jù)。
　　 5．為提高DNA疫苗保護(hù)力，從免疫劑量、免疫次數(shù)、免疫途徑、末次免疫后攻擊感染時(shí)間四個(gè)因素個(gè)三個(gè)水平，探索和研究免疫優(yōu)化方案。在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，四個(gè)因素三個(gè)水平無(wú)顯著性差異，但傾向于此范圍內(nèi)：50μg、免疫2次、皮內(nèi)免疫和免疫12周后攻擊感染為本次試驗(yàn)的最佳免疫方